【摘要】： 目的：原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),用第2代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以20mM的右旋葡萄糖(D-glucose)分別處理細(xì)胞24h和7d,觀察各不同處理組細(xì)胞的氧化應(yīng)激指標(biāo)及窖蛋白-1(Caveolin-1, Cav-1)、蛋白激酶Cα(PKCα)、硒蛋白S(SelS)在1nRNA和蛋白水平表達(dá)的差異,研究高糖對HUVEC的損傷作用是否通過PKC通路發(fā)揮作用,及此通路與Cav-1、SelS的關(guān)系,為研究內(nèi)皮保護(hù)策略提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1. HUVEC的原代培養(yǎng)及鑒定。 2.細(xì)胞分別在含D-glucose為5.5mM(正常組)、10mM(HG10組)、20mM(HG20組)、30mM(HG30組)的培養(yǎng)液及含5.5mM D-glucose和14.5mM甘露醇(甘露醇組)的培養(yǎng)液中干預(yù)24h和48h后,用四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)檢測不同濃度D-glucose對細(xì)胞增殖能力的影響；取各組細(xì)胞上清液,用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(Malondialdehyde, MDA)的含量,黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)的活力。 3.依據(jù)MTT結(jié)果,以HG20組作為高糖組,以甘露醇組作為滲透壓對照,與正常組共同處理24小時(shí)后提取各組細(xì)胞總RNA及總蛋白。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測各組細(xì)胞Cav-1、SelS及PKCa在mRNA水平的表達(dá)差異：Western blot方法檢測Cav-1、SelS及PKCa在蛋白水平的表達(dá)差異。 4.以含5.5mM和20mM的D-glucose隔日波動(dòng)干預(yù)為波動(dòng)組,與高糖組、正常組及甘露醇組共同處理7天后提取各組細(xì)胞總RNA及總蛋白,采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測各組細(xì)胞Cav-1、SelS及PKCa在mRNA水平的表達(dá)；Western blot的方法檢測Cav-1、SelS及PKCa在蛋白水平的表達(dá)差異。 結(jié)果： 1.成功培養(yǎng)了原代HUVEC,經(jīng)鑒定第2代細(xì)胞HUVEC的陽性率為98.46。 2.細(xì)胞生存率(%)：處理24h后,HG20組及HG30組細(xì)胞生存率與正常組相比明顯下降(P0.01),分別為71±1.5、60±0.5和93±1.5；不同條件培養(yǎng)48h后,HG20組及HG30組細(xì)胞生存率與正常組相比進(jìn)一步降低(P0.01),分別為65±2.0、53±1.5及92±3.0。處理24h和48h,HG10組、甘露醇組細(xì)胞生存率與正常組相比均差異(P0.05),分別為89±1.5、91±1.2、93±1.5以及85±2.6、88±2.9、92±3.0。 3.MDA含量(nmol／ml)：各組細(xì)胞上清中MDA含量隨葡萄糖濃度的升高而增加。處理24h后,HG20組及HG30組細(xì)胞上清MDA含量與正常組相比明顯著升高(P0.01),分別為6.28±0.29、11.28±0.40及0.93±0.66；處理48h后,HG20組及HG30組細(xì)胞上清MDA含量進(jìn)一步升高(P0.01),分別為8.99±0.19和15.93±0.57。無論是處理24h還是處理48h,HG10組、甘露醇組與正常組細(xì)胞上清中MDA含量相比均無差異(P0.05),分別為1.17±0.21、1.03±0.46、0.93±0.66以及1.22±0.33、1.07±0.21、0.97±0.36。 4.SOD活力(U／ml)：各組細(xì)胞上清液中SOD的活力隨著葡萄糖濃度的升高而減弱。處理24h后,HG20組及HG30組細(xì)胞上清SOD活力與正常組相比顯著減弱(P0.01),分別為6.82±0.23、5.70±0.22及8.62±0.09。處理48h后,HG20組及HG30組細(xì)胞上清SOD活力進(jìn)一步減弱(P0.01),分別為6.044±0.16和5.08±0.87。處理24h和48h后,HG10組、甘露醇組細(xì)胞上清中SOD活力與正常組相比均無差異(P0.05),分別為：8.10±0.80、8.32±2.33、8.62±0.09及7.74±0.12、7.80±1.58、8.23±0.46。 5.Cav-1的表達(dá)：處理24h和7d后,高糖組Cav-1 mRNA表達(dá)與正常組相比明顯升高(P0.01),分別為1.12±0.21、0.76±0.04及1.48±0.35、0.74±0.13；波動(dòng)組進(jìn)一步升高,為2.16±0.02,且波動(dòng)組Cav-1 mRNA表達(dá)亦高于高糖組(P0.01)；無論是24h還是7d,甘露醇組Cav-1 mRNA表達(dá)與正常組相比無差異(P0.05),分別為0.79±0.05、0.76±0.04及0.75±0.02、0.74±0.13。同樣的,處理24h和7d后高糖組Cav-1在蛋白水平的表達(dá)與正常組相比明顯升高(P0.05)(P0.01),分別為1.62±0.07、1.21±0.01及0.69±0.02、0.32±0.01。波動(dòng)組Cav-1蛋白的表達(dá)進(jìn)一步升高,為1.14±0.02,且波動(dòng)組Cav-1蛋白表達(dá)水平亦高于高糖組(P0.01)；無論處理24h還是7d,甘露醇組Cav-1蛋白表達(dá)水平與正常組相比無差異(P0.05),分別為1.21±0.02、1.21±0.01及0.34±0.02、0.32±0.01。 6. SelS的表達(dá)：不同條件處理24h及7d后,高糖組SelS mRNA表達(dá)水平與正常組相比無差異(P0.05),分別為：1.32±0.12、1.28±0.03、及1.33±0.01、1.27±0.02；處理7d后,波動(dòng)組SelS mRNA表達(dá)與高糖組及正常組相比無差異(P0.05),為1.33±0.01；無論處理24h還是7d,甘露醇組與正常組SelS mRNA表達(dá)水平相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),分別為1.27±0.08及1.31±0.01。同樣的,處理24h和7d后,SelS蛋白的表達(dá)水平在正常糖組及高糖組分別為：0.38±0.02、0.43±0.08及0.68±0.04、0.69±0.04,均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。處理7d后,波動(dòng)組SelS蛋白表達(dá)與高糖組及正常組相比無差異(P0.05),為0.70±0.01；無論處理24h還是處理7d,甘露醇組SelS的蛋白表達(dá)水平與正常組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),為0.42±0.02和0.69±0.01。 7.PKCα的表達(dá)：不同濃度葡萄糖處理24h及7天后,高糖組PKCαmRNA表達(dá)水平與正常組相比無差異(P0.05)分別為：1.38±0.14、1.36±0.33和1.38±0.28、1.35±0.46；處理7d后,波動(dòng)組PKCa mRNA表達(dá)水平與高糖組及正常組相比均無差異(P0.05),為1.39±0.03；無論處理24h還是7d,甘露醇組與正常組PKCa mRNA表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),為1.40±0.06和1.42±0.01。同樣的,不同處理24h及7d后,高糖組PKCa蛋白表達(dá)水平與正常組相比無差異(P0.05),分別為：0.83±0.02、0.84±0.02及1.03±0.02、0.98±0.04；處理7d后,波動(dòng)組PKCa蛋白表達(dá)水平與高糖組及正常組相比亦無差異(P0.05)為：0.99±0.02；無論處理24h還是7d,PKCa蛋白表達(dá)水平在甘露醇組與正常組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),分別為0.82±0.02和0.96±0.03。 結(jié)論： 1.高糖對內(nèi)皮細(xì)胞的生長有抑制作用,高糖損傷后細(xì)胞MDA的生成增加,SOD活力降低,具有降低內(nèi)皮細(xì)胞生存率的作用。 2.恒定高糖及波動(dòng)高糖對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷可能與Cav-1相關(guān),而不同濃度葡萄糖及波動(dòng)高糖處理后PKCα和SelS的表達(dá)無論在mRNA水平還是蛋白水平均無差異。
【圖文】：

注:A:B:圖4流式細(xì)胞術(shù)鑒定HUVEC第一代HuVEC陰性對照(陰性率為0.96%)第一代樣品陽性率(陽性率為90.33%)第二代陰性對照(陰性率為0.82%)第二代樣品陽性率(陽性率為98.46%)DC

各組Cav一1實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2565649