發(fā)布時(shí)間：2019-11-22 01:14

【摘要】： 有關(guān)RA治療策略的探索始終是國(guó)內(nèi)外尤為關(guān)注的焦點(diǎn)、熱點(diǎn)和難點(diǎn)。由于迄今對(duì)于RA的病因認(rèn)識(shí)不清,對(duì)其病機(jī)了解不深,目前尚無任何特異性根治療法。所使用的藥物與方案也就是非特異性緩解對(duì)癥療法,都必然會(huì)產(chǎn)生多種多樣的嚴(yán)重毒副作用。因此,如何能發(fā)現(xiàn)或發(fā)明理想、高效、低毒、特異的藥物,使其既能迅速緩解RA的表癥,而且更能有效地針對(duì)其病機(jī),選擇性地阻斷其病理生理過程的全新型制劑已是風(fēng)濕學(xué)領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵首要問題!業(yè)已證明,RA是一種抗原驅(qū)動(dòng)由CD4+CD28+Th1細(xì)胞介導(dǎo)的全身性自身免疫病。鑒于RA病人的滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞變形與免疫功能的改變密切相關(guān),近年來國(guó)外趨向于將對(duì)免疫調(diào)節(jié)作用的藥物作為治療RA的第一線藥,并對(duì)RA新的免疫治療策略進(jìn)行了廣泛的研究。“基因或DNA治療性疫苗”就是其中最受重視和最為推崇的一種,它是自二十世紀(jì)九十年代國(guó)際上興起治療自身免疫病的特異性免疫療法之一,也是近年來免疫學(xué)研究領(lǐng)域中最活躍、最富有成效的領(lǐng)域之一。 從理論上講,任何能夠有效減少、抑制或阻斷RA病理生理發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程的藥物都能有效減輕或緩解RA的骨關(guān)節(jié)病變。鑒于B7:CD28/CTLA4共刺激信號(hào)途徑在其發(fā)生發(fā)展的病理生理過程中發(fā)揮重要作用這一事實(shí),選擇性阻斷B7:CD28/CTLA4共刺激信號(hào)途徑誘導(dǎo)免疫耐受已成為有效防治自身免疫性疾病的重要策略之一。其中最具代表性的突破則是完全人源化新型重組融合蛋白CTLA4-Ig的研發(fā)成功,它能選擇性阻斷B7:CD28/CTLA4系統(tǒng)并在防治RA的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)尤其是臨床研究中取得顯著療效。2005年12月美國(guó)FDA在國(guó)際上首次正式批準(zhǔn)CTLA4-Ig作為一線藥臨床應(yīng)用于中至重度RA的治療。從而為這一策略的更深入研究尤其是RA的臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。然而,縱觀目前國(guó)際上探索B7:CD28/CTLA-4系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫耐受防治RA的研究手段,采用的均是以CTLA4-Ig或抗B7單抗/多抗來進(jìn)行封閉或阻斷。其缺陷在于:第一,無論是抗CTLA4-Ig或B7單抗/多抗的封閉或阻斷,均不能誘導(dǎo)長(zhǎng)期免疫耐受;第二,僅僅封閉B7:CD28/ CTLA-4系統(tǒng)所誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫耐受可被感染等因素所引起釋放的IL-2及其它細(xì)胞因子所逆轉(zhuǎn),導(dǎo)致治療無效或失敗;第三,仍存在其它的共刺激信號(hào)途徑可以補(bǔ)償CD28信號(hào)的缺失,而旁路激活CD28+T細(xì)胞。針對(duì)上述缺陷,本課題擬將免疫耐受與基因治療性疫苗兩大策略充分進(jìn)行有機(jī)結(jié)合創(chuàng)新性研制全新型pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗,并系統(tǒng)觀察了該新型疫苗對(duì)CIA防治的療效,探討了其相關(guān)作用機(jī)制,獲得如下研究結(jié)果: 勿庸置疑,本研究的關(guān)鍵是能否成功構(gòu)建在真核細(xì)胞中高效表達(dá)的pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗。為此,本課題首先以原核表達(dá)載體pRSETA/B7-2-PE40KDEL質(zhì)粒為模板,采用PCR及酶切連接的方法構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1/B7-2-PE40。在基因測(cè)序證實(shí)B7-2-PE40真核表達(dá)載體構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將B7-2-PE40真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入CHO-K1-RPE.40細(xì)胞,經(jīng)ZeocinTM篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后,利用RT-PCR、Western Blot及ELISA的方法分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)了B7-2-PE40在CHO-K1-RPE.40真核細(xì)胞中的表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞的pcDNA3.1/ B7-2-PE40質(zhì)粒經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后修飾被分泌至胞外,相對(duì)分子質(zhì)量約為90kDa,平均106個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h表達(dá)0.23μg/L。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞與CD28高表達(dá)細(xì)胞系人淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat和CD28低表達(dá)的人Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞系Raji共孵育,采用MTT法對(duì)其特異性殺傷活性進(jìn)行了測(cè)定�；钚詼y(cè)定顯示,真核載體所表達(dá)的B7-2-PE40能特異性殺傷高表達(dá)CD28的Jurkat細(xì)胞,而對(duì)低表達(dá)CD28的Raji細(xì)胞抑制率甚低。由此證明本課題構(gòu)建的pcDNA3.1/B7-2-PE40真核表達(dá)載體可在真核細(xì)胞中高效表達(dá),且表達(dá)產(chǎn)物具有很好的靶向免疫抑制活性。 在此基礎(chǔ)上,我們選擇了肌肉注射結(jié)合電脈沖刺激的方法,將150μg pcDNA3.1/ B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗注入CIA大鼠體內(nèi),利用RT-PCR和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法檢測(cè)了B7-2-PE40在活體內(nèi)的表達(dá)情況及生物學(xué)活性。結(jié)果顯示pcDNA3.1/B7-2-PE40質(zhì)粒進(jìn)入機(jī)體2天即可檢測(cè)出mRNA,14天達(dá)到高峰,而后逐漸減弱,至第56天基本檢測(cè)不到。其真核表達(dá)產(chǎn)物B7-2-PE40可發(fā)揮特異性細(xì)胞殺傷活性,在pcDNA3.1/B7-2-PE40質(zhì)粒肌肉注射第2d時(shí),CIA大鼠體內(nèi)CD28+T細(xì)胞已被明顯殺傷。第4天時(shí),CD28+T細(xì)胞下降至最低,達(dá)34%。此后有短暫恢復(fù)。隨著B7-2-PE40在14天表達(dá)高峰的到來,在第21天時(shí)再一次下降至低谷。后由于B7-2-PE40表達(dá)的降低,CD28+ T細(xì)胞所占比例逐漸增加,并于第56天時(shí)恢復(fù)至正常水平。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,pcDNA3.1/B7-2-PE40質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物作為異源蛋白在體內(nèi)的的抗原性較低,基本上不產(chǎn)生針對(duì)PE40的抗體。上述結(jié)果表明,我們所研制的pcDNA3.1/ B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗可在大鼠體內(nèi)表達(dá)并發(fā)揮作用。 那么,這種全新型的pcDNA3.1/ B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗所表達(dá)的產(chǎn)物是否具有生物學(xué)功能?尤其是在RA大鼠模型體內(nèi)能否有效的防治CIA病情的發(fā)生與發(fā)展?這是我們最為關(guān)注的大問題。因此我們采用雞Ⅱ型膠原在Wistar大鼠中建立了CIA作為RA的動(dòng)物模型,造模成功率為80%。經(jīng)四肢關(guān)節(jié)腫脹程度評(píng)分、放射影像學(xué)和組織病理學(xué)驗(yàn)證,該模型與文獻(xiàn)報(bào)道的一致,完全符合CIA大鼠RA模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)治療的標(biāo)準(zhǔn)要求。而后我們分別觀察了該新型外毒素融合基因疫苗預(yù)防和治療CIA大鼠的效應(yīng)。將不同劑量的pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗分別在誘導(dǎo)CIA模型的當(dāng)天預(yù)防性或第12天治療性給予CIA大鼠,綜合四肢關(guān)節(jié)腫脹程度評(píng)分、組織病理學(xué)變化和抗CⅡ抗體的滴度變化來系統(tǒng)評(píng)價(jià)對(duì)CIA疾病進(jìn)程的影響。預(yù)防各組在誘導(dǎo)CIA模型的第一周中均會(huì)出現(xiàn)微弱的關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)。隨著B7-2-PE40質(zhì)粒的表達(dá),關(guān)節(jié)炎癥狀會(huì)逐漸消失。劑量為200μg/只的預(yù)防組在10周內(nèi)均能很好地抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)生,減輕關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度,其效果優(yōu)于“金標(biāo)準(zhǔn)”的MTX組。而在劑量為300μg/只的預(yù)防組中僅部分地抑制了關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生,從第3周起,關(guān)節(jié)炎癥逐漸明顯。pcDNA3.1空載體預(yù)防組無任何預(yù)防效果,其臨床積分類似于CIA對(duì)照組。治療各組是在誘導(dǎo)CIA模型的第12天出現(xiàn)足爪紅腫時(shí),分別給予每只150μg、200μg和300μg劑量的pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給予基因疫苗治療的第5天后即開始發(fā)揮作用,一直延續(xù)到第10周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后。200μg/只治療組、300μg/只治療組的療效與標(biāo)準(zhǔn)低劑量MTX/1次/周×4周治療組的接近,均可明顯減輕四肢關(guān)節(jié)腫脹程度,降低疾病發(fā)生率;而150μg/只治療組的關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)略高于上述三組,但明顯低于pcDNA3.1空載體治療組及CIA對(duì)照組。與CIA對(duì)照組相比,pcDNA3.1空載體組對(duì)CIA大鼠四肢關(guān)節(jié)腫脹程度無任何治療作用,兩組的臨床評(píng)分基本接近。應(yīng)說明的是,在300μg/只治療組大鼠膠原注射處可見潰瘍形成,且經(jīng)久不愈。組織病理結(jié)果與肉眼觀察相一致;pcDNA3.1空載體對(duì)照組的結(jié)果與CIA組類似。而經(jīng)pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗預(yù)防及治療后的各組均有一定程度的改善:滑膜增生減弱,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,少見纖維樣物質(zhì)沉積,基本看不到骨及軟骨的破壞。在治療各組中,MTX治療組病理改變最好,其次為200μg治療組;而在預(yù)防各組中,200μg預(yù)防組病理改善表現(xiàn)優(yōu)于MTX預(yù)防組。300μg預(yù)防組的病理表現(xiàn)類似于CIA對(duì)照組,可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn),纖維增生,局部有壞死及肉芽腫形成。通過ELISA檢測(cè)體內(nèi)抗CⅡ抗體滴度的變化表明,與CIA對(duì)照組相比,200μg預(yù)防組和MTX組可明顯降低體內(nèi)抗CⅡ抗體水平(P0.05),而其他各組盡管也能降低抗CⅡ抗體水平,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果提示200μg/只劑量的pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗可有效防治CIA疾病的發(fā)生,緩解CIA疾病的進(jìn)程。 為了探索pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗有效防治CIA大鼠的相關(guān)機(jī)制,我們系統(tǒng)觀察了CIA大鼠注射pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗后對(duì)其免疫系統(tǒng)的影響。研究結(jié)果表明,該基因疫苗在體內(nèi)所表達(dá)的B7-2-PE40能有效殺傷CD28+ T細(xì)胞,提高CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞亞群及CD8+ CD28- Ts細(xì)胞亞群的比例;有效糾正CIA產(chǎn)生的Th1偏移,下調(diào)CD4/CD8比值,明顯降低炎性細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ的濃度(P0.05),抑制IFN-γ分泌型Th1細(xì)胞的產(chǎn)生,促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10及IL-4分泌型Th2細(xì)胞的生成。而對(duì)IL-2和TGF-β的影響不大,尤其是對(duì)IL-4基本沒有影響。上述結(jié)果證實(shí)pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗主要是通過抑制致病性T細(xì)胞的活化,糾正T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡,抑制B細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)膠原的體液免疫應(yīng)答來有效控制并減緩CIA的發(fā)生與發(fā)展的。 總之,本研究在國(guó)際上原創(chuàng)性的研制成功首個(gè)新型pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗,它能在體內(nèi)有效表達(dá)具有特異靶向阻斷B7:CD28共刺激信號(hào)途徑的B7-2-PE40外毒素融合蛋白,經(jīng)CIA大鼠模型證實(shí)該基因疫苗能有效地預(yù)防和治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展,并對(duì)其相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行了探討,為今后臨床進(jìn)一步研究及應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ),也為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療提供了更多更廣的新思路和新策略。
【圖文】：

抗性基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/B7-2-PE40按圖1所示構(gòu)建（真核表達(dá)載體圖見附錄1）。用所設(shè)計(jì)的PCR引物擴(kuò)增人B7-2-PE40，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見預(yù)期大小為1919bp的特異性條帶（圖2）。將雙酶切回收后產(chǎn)物克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Zeo(+)的KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，，構(gòu)建成pcDNA3.1/B7-2-PE40 重組質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒提取、雙酶切后電泳（圖3）和測(cè)序鑒定結(jié)果（圖4，測(cè)序圖見附錄2），得到陽性克隆。測(cè)序顯示信號(hào)肽之后的堿基序列沒有發(fā)生點(diǎn)突變和移碼突變，與原核表達(dá)質(zhì)粒pRSETA－B7-2-PE40KDEL中的基因序列完全一致，與人B7-2以及PE40蛋白一、二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果見表1。

2.1 pcDNA3.1/B7-2-PE40 真核表達(dá)載體的構(gòu)建為使B7-2-PE40融合基因可在真核細(xì)胞中表達(dá)，一個(gè)含有B7-2-PE40以及Zeo抗性基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/B7-2-PE40按圖1所示構(gòu)建（真核表達(dá)載體圖見附錄1）。用所設(shè)計(jì)的PCR引物擴(kuò)增人B7-2-PE40，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見預(yù)期大小為1919bp的特異性條帶（圖2）。將雙酶切回收后產(chǎn)物克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Zeo(+)的KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成pcDNA3.1/B7-2-PE40 重組質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒提取、雙酶切后電泳（圖3）和測(cè)序鑒定結(jié)果（圖4，測(cè)序圖見附錄2），得到陽性克隆。測(cè)序顯示信號(hào)肽之后的堿基序列沒有發(fā)生點(diǎn)突變和移碼突變，與原核表達(dá)質(zhì)粒pRSETA－B7-2-PE40KDEL中的基因序列完全一致
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2564256