【摘要】： 第一部分自身免疫調(diào)節(jié)因子與大分子自噬 目的 自身免疫調(diào)節(jié)因子(AIRE)具有誘導(dǎo)中樞免疫耐受的潛能,但在外周免疫耐受中,其功能未明�？紤]大分子自噬可參與免疫耐受的誘導(dǎo),我們初步探討了自身免疫調(diào)節(jié)因子在外周中的表達(dá)及其對(duì)外周單核細(xì)胞系THP-1大分子自噬的影響。 方法 真核表達(dá)載體pEGFP-AIRE經(jīng)雙限制性酶切、PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序分析鑒定；依據(jù)密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞及單核細(xì)胞的分離；THP-1細(xì)胞由佛波醇酯誘導(dǎo)分化后通過(guò)瑞氏-姬姆薩染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；細(xì)胞轉(zhuǎn)染按脂質(zhì)體法進(jìn)行；AIRE表達(dá)抑制采用siRNA的方法；熒光顯微鏡觀察GFP-AIRE融合蛋白的表達(dá)和亞細(xì)胞定位；轉(zhuǎn)染效率經(jīng)RT-PCR與Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證；自噬小體在胞內(nèi)的形成和定位通過(guò)間接免疫熒光染色指示；大分子自噬的抑制采用PI3K抑制劑(渥曼青霉素)進(jìn)行誘導(dǎo)；LC3B-Ⅱ與p62/SQSTM1的蛋白表達(dá)變化經(jīng)Western Blot進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果 質(zhì)粒DNA經(jīng)雙酶切、PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳后可見特異性條帶；DNA測(cè)序結(jié)果顯示測(cè)定序列與AIRE (NM_000383.2)基因序列符合率99%(BLAST評(píng)分1698)。外周血單個(gè)核細(xì)胞、單核細(xì)胞、U937和THP-1細(xì)胞存在AIRE mRNA表達(dá)；單核細(xì)胞和THP-1細(xì)胞僅表達(dá)低水平AIRE蛋白。誘導(dǎo)后,THP-1細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng),胞體增大,形態(tài)多樣性,核不規(guī)則,胞漿內(nèi)空泡,吞噬細(xì)胞碎片等典型成熟分化形態(tài)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,熒光顯微鏡顯示GFP-AIRE融合蛋白以斑點(diǎn)狀定位于細(xì)胞核內(nèi)；在mRNA和蛋白水平,AIRE均呈明顯高表達(dá)；而AIRE siRNA則明顯抑制GFP-AIRE融合蛋白及AIRE mRNA與蛋白的表達(dá)。過(guò)表達(dá)AIRE可上調(diào)LC3B-Ⅱ的表達(dá)和自噬小體的形成；而大分子自噬抑制劑與AIRE siRNA可抑制AIRE介導(dǎo)的上調(diào)效應(yīng)。過(guò)表達(dá)AIRE或大分子自噬抑制劑與AIRE siRNA對(duì)p62/SQSTM1蛋白表達(dá)無(wú)影響。 結(jié)論 真核表達(dá)載體pEGFP-AIRE構(gòu)建正確,可應(yīng)用于體外轉(zhuǎn)染研究。AIRE可表達(dá)于外周單核細(xì)胞并通過(guò)上調(diào)LC3B-Ⅱ的表達(dá)和自噬小體的形成促進(jìn)單核細(xì)胞大分子自噬。AIRE介導(dǎo)單核細(xì)胞大分子自噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能與p62/SQSTM1蛋白無(wú)關(guān)。通過(guò)促進(jìn)單核細(xì)胞大分子自噬,AIRE可能在外周免疫耐受中具有功能。 第二部分自身免疫調(diào)節(jié)因子與凋亡細(xì)胞的吞噬清除 目的 凋亡細(xì)胞是自身抗原成分的主要來(lái)源之一,適時(shí)清除凋亡細(xì)胞對(duì)維持免疫自穩(wěn)具有重要意義。作為細(xì)胞死亡的兩種不同形式——大分子自噬與凋亡共享許多調(diào)節(jié)因子,基于本文第一部分研究結(jié)果,為繼續(xù)探討自身免疫調(diào)節(jié)因子(AIRE)在外周免疫耐受中的功能,我們?cè)诜恰奥殬I(yè)”吞噬細(xì)胞——上皮細(xì)胞系16HBE中探討了AIRE對(duì)吞噬凋亡細(xì)胞的影響。 方法 16HBE細(xì)胞的轉(zhuǎn)染使用來(lái)源于第一部分研究的真核表達(dá)載體pEGFP-AIRE通過(guò)FuGENEHD轉(zhuǎn)染法進(jìn)行；轉(zhuǎn)染效率經(jīng)熒光顯微鏡、RT-PCR與Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證；HL-60細(xì)胞的凋亡由喜樹堿誘導(dǎo)后通過(guò)Annexin V-FITC/碘化丙啶雙染色進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)：吞噬凋亡細(xì)胞的檢測(cè)通過(guò)髓過(guò)氧化物酶(MPO)染色進(jìn)行顯示；吞噬相關(guān)基因(Rac 1)的表達(dá)變化經(jīng)RT-PCR與Western Blot進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果 pEGFP-AIRE轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,熒光顯微鏡顯示GFP-AIRE融合蛋白以斑點(diǎn)狀定位于16HBE細(xì)胞核內(nèi)；通過(guò)RT-PCR與Western Blot檢測(cè),AIRE mRNA和蛋白均呈明顯高表達(dá)。對(duì)比未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)的陰性對(duì)照組,流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,喜樹堿誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡率上升約3倍[(4.08±0.26)%Vs(13.46±1.71)%]。在與凋亡細(xì)胞共孵育1小時(shí)后,可見轉(zhuǎn)AIRE基因16HBE細(xì)胞吞噬率為(25.5±3.67)%,而轉(zhuǎn)染空載體16HBE細(xì)胞吞噬率為(6.25±1.58)%,兩者間具有顯著性差異(P0.05)；但過(guò)表達(dá)AIRE對(duì)16HBE細(xì)胞吞噬未凋亡細(xì)胞無(wú)明顯影響[(1.0±0.67)%]。同時(shí),過(guò)表達(dá)AIRE可上調(diào)16HBE細(xì)胞Rac 1 mRNA和蛋白表達(dá)。 結(jié)論 16HBE細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞具有基礎(chǔ)吞噬率,可作為體外研究吞噬凋亡細(xì)胞的細(xì)胞模型。MPO染色法對(duì)檢測(cè)吞噬來(lái)源于MPO陽(yáng)性靶細(xì)胞的吞噬效應(yīng)具有較好對(duì)比度,可作為體外顯示吞噬效應(yīng)的檢測(cè)方法。AIRE可促進(jìn)上皮細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬,通過(guò)上調(diào)Rac1的表達(dá)促進(jìn)對(duì)凋亡細(xì)胞吞噬清除防止“自我”抗原“暴露”,AIRE可能在外周免疫耐受中具有功能。
【圖文】：

序是鑒定載體中目的基因的理想方法。如圖l所示，經(jīng)EcoRI與Sall雙瓊脂糖凝膠電泳后可見環(huán)狀的質(zhì)粒DNA被酶切為含目的基因(A工RE，1638體序列(3062bp)的兩條特異性條帶，而未被酶切的完整質(zhì)粒DNA則顯示和開環(huán)兩種形式的條帶，其中超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒(即位于下方的條帶)含量豐，以針對(duì)AIRE設(shè)計(jì)的特異性引物、純化的質(zhì)粒DNA為模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，RE的特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(250bp)(圖2)。質(zhì)粒DNA的測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLA比對(duì)后，顯示測(cè)定序列(評(píng)分1698)與AIRE(NM--000383.2)基因序列的符%。因此，，通過(guò)雙限制性核酸內(nèi)切酶酶切、特異性引物PCR擴(kuò)增和質(zhì)粒DNA明了載體的構(gòu)建正確。

螺旋和開環(huán)兩種形式的條帶，其中超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒(即位于下方的條帶)含量豐富。同時(shí)，以針對(duì)AIRE設(shè)計(jì)的特異性引物、純化的質(zhì)粒DNA為模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可見AIRE的特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 (250bp)(圖2)。質(zhì)粒DNA的測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，顯示測(cè)定序列(評(píng)分1698)與AIRE(NM--000383.2)基因序列的符合率為99%。因此，通過(guò)雙限制性核酸內(nèi)切酶酶切、特異性引物PCR擴(kuò)增和質(zhì)粒DNA的測(cè)序證明了載體的構(gòu)建正確。AIR尼(，63公卜P)圖1質(zhì)粒ONA的雙酶切 M:DNAMarkerl，3，5:PEGFP·AIREZ，4，6:AIRE24
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2564125