【摘要】： 第一部分自身免疫調節(jié)因子與大分子自噬 目的 自身免疫調節(jié)因子(AIRE)具有誘導中樞免疫耐受的潛能,但在外周免疫耐受中,其功能未明。考慮大分子自噬可參與免疫耐受的誘導,我們初步探討了自身免疫調節(jié)因子在外周中的表達及其對外周單核細胞系THP-1大分子自噬的影響。 方法 真核表達載體pEGFP-AIRE經(jīng)雙限制性酶切、PCR擴增及DNA測序分析鑒定；依據(jù)密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)法進行外周血單個核細胞及單核細胞的分離；THP-1細胞由佛波醇酯誘導分化后通過瑞氏-姬姆薩染色進行形態(tài)學鑒定；細胞轉染按脂質體法進行；AIRE表達抑制采用siRNA的方法；熒光顯微鏡觀察GFP-AIRE融合蛋白的表達和亞細胞定位；轉染效率經(jīng)RT-PCR與Western Blot進行驗證；自噬小體在胞內的形成和定位通過間接免疫熒光染色指示；大分子自噬的抑制采用PI3K抑制劑(渥曼青霉素)進行誘導；LC3B-Ⅱ與p62/SQSTM1的蛋白表達變化經(jīng)Western Blot進行檢測。 結果 質粒DNA經(jīng)雙酶切、PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳后可見特異性條帶；DNA測序結果顯示測定序列與AIRE (NM_000383.2)基因序列符合率99%(BLAST評分1698)。外周血單個核細胞、單核細胞、U937和THP-1細胞存在AIRE mRNA表達；單核細胞和THP-1細胞僅表達低水平AIRE蛋白。誘導后,THP-1細胞呈貼壁生長,胞體增大,形態(tài)多樣性,核不規(guī)則,胞漿內空泡,吞噬細胞碎片等典型成熟分化形態(tài)。質粒轉染48小時后,熒光顯微鏡顯示GFP-AIRE融合蛋白以斑點狀定位于細胞核內；在mRNA和蛋白水平,AIRE均呈明顯高表達；而AIRE siRNA則明顯抑制GFP-AIRE融合蛋白及AIRE mRNA與蛋白的表達。過表達AIRE可上調LC3B-Ⅱ的表達和自噬小體的形成；而大分子自噬抑制劑與AIRE siRNA可抑制AIRE介導的上調效應。過表達AIRE或大分子自噬抑制劑與AIRE siRNA對p62/SQSTM1蛋白表達無影響。 結論 真核表達載體pEGFP-AIRE構建正確,可應用于體外轉染研究。AIRE可表達于外周單核細胞并通過上調LC3B-Ⅱ的表達和自噬小體的形成促進單核細胞大分子自噬。AIRE介導單核細胞大分子自噬的信號轉導通路可能與p62/SQSTM1蛋白無關。通過促進單核細胞大分子自噬,AIRE可能在外周免疫耐受中具有功能。 第二部分自身免疫調節(jié)因子與凋亡細胞的吞噬清除 目的 凋亡細胞是自身抗原成分的主要來源之一,適時清除凋亡細胞對維持免疫自穩(wěn)具有重要意義。作為細胞死亡的兩種不同形式——大分子自噬與凋亡共享許多調節(jié)因子,基于本文第一部分研究結果,為繼續(xù)探討自身免疫調節(jié)因子(AIRE)在外周免疫耐受中的功能,我們在非“職業(yè)”吞噬細胞——上皮細胞系16HBE中探討了AIRE對吞噬凋亡細胞的影響。 方法 16HBE細胞的轉染使用來源于第一部分研究的真核表達載體pEGFP-AIRE通過FuGENEHD轉染法進行；轉染效率經(jīng)熒光顯微鏡、RT-PCR與Western Blot進行驗證；HL-60細胞的凋亡由喜樹堿誘導后通過Annexin V-FITC/碘化丙啶雙染色進行流式細胞儀檢測：吞噬凋亡細胞的檢測通過髓過氧化物酶(MPO)染色進行顯示；吞噬相關基因(Rac 1)的表達變化經(jīng)RT-PCR與Western Blot進行檢測。 結果 pEGFP-AIRE轉染48小時后,熒光顯微鏡顯示GFP-AIRE融合蛋白以斑點狀定位于16HBE細胞核內；通過RT-PCR與Western Blot檢測,AIRE mRNA和蛋白均呈明顯高表達。對比未經(jīng)凋亡誘導的陰性對照組,流式細胞儀檢測顯示,喜樹堿誘導的HL-60細胞凋亡率上升約3倍[(4.08±0.26)%Vs(13.46±1.71)%]。在與凋亡細胞共孵育1小時后,可見轉AIRE基因16HBE細胞吞噬率為(25.5±3.67)%,而轉染空載體16HBE細胞吞噬率為(6.25±1.58)%,兩者間具有顯著性差異(P0.05)；但過表達AIRE對16HBE細胞吞噬未凋亡細胞無明顯影響[(1.0±0.67)%]。同時,過表達AIRE可上調16HBE細胞Rac 1 mRNA和蛋白表達。 結論 16HBE細胞對凋亡細胞具有基礎吞噬率,可作為體外研究吞噬凋亡細胞的細胞模型。MPO染色法對檢測吞噬來源于MPO陽性靶細胞的吞噬效應具有較好對比度,可作為體外顯示吞噬效應的檢測方法。AIRE可促進上皮細胞對凋亡細胞的吞噬,通過上調Rac1的表達促進對凋亡細胞吞噬清除防止“自我”抗原“暴露”,AIRE可能在外周免疫耐受中具有功能。
【圖文】：

序是鑒定載體中目的基因的理想方法。如圖l所示，經(jīng)EcoRI與Sall雙瓊脂糖凝膠電泳后可見環(huán)狀的質粒DNA被酶切為含目的基因(A工RE，1638體序列(3062bp)的兩條特異性條帶，而未被酶切的完整質粒DNA則顯示和開環(huán)兩種形式的條帶，其中超螺旋狀態(tài)的質粒(即位于下方的條帶)含量豐，以針對AIRE設計的特異性引物、純化的質粒DNA為模板的PCR擴增反應，RE的特異性PCR擴增產(chǎn)物(250bp)(圖2)。質粒DNA的測序結果經(jīng)BLA比對后，顯示測定序列(評分1698)與AIRE(NM--000383.2)基因序列的符%。因此，，通過雙限制性核酸內切酶酶切、特異性引物PCR擴增和質粒DNA明了載體的構建正確。

螺旋和開環(huán)兩種形式的條帶，其中超螺旋狀態(tài)的質粒(即位于下方的條帶)含量豐富。同時，以針對AIRE設計的特異性引物、純化的質粒DNA為模板的PCR擴增反應，可見AIRE的特異性PCR擴增產(chǎn)物 (250bp)(圖2)。質粒DNA的測序結果經(jīng)BLAST數(shù)據(jù)庫比對后，顯示測定序列(評分1698)與AIRE(NM--000383.2)基因序列的符合率為99%。因此，通過雙限制性核酸內切酶酶切、特異性引物PCR擴增和質粒DNA的測序證明了載體的構建正確。AIR尼(，63公卜P)圖1質粒ONA的雙酶切 M:DNAMarkerl，3，5:PEGFP·AIREZ，4，6:AIRE24
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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