【摘要】： 目的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植對多種原因引起的肝損傷具有顯著修復(fù)作用,可改善甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化,但逆轉(zhuǎn)肝纖維化的機(jī)制未明。肝星狀細(xì)胞(HSCs)的激活在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。因此,深入探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡的影響及作用機(jī)制,具有重要意義。通過觀察體外大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡和RhoA表達(dá)的影響,探討B(tài)MSCs旁分泌肝細(xì)胞生長因子(HGF)在其中的作用機(jī)制。 方法貼壁篩選法培養(yǎng)、純化SD大鼠BMSCs,傳代至第4代使用；大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)系及纖維原細(xì)胞系凍融后傳代使用。應(yīng)用6孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)盒,在半透膜(transwell insert)上層接種MSCs(1×105)cells／well,在下層接種HSC-T6細(xì)胞(1×105)cells/well,建立上下雙層細(xì)胞共培養(yǎng)體系,常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組：①空白對照組：HSCs單獨(dú)培養(yǎng)；②實(shí)驗(yàn)對照組：纖維原細(xì)胞(Fiberoblasts)與HSCs共培養(yǎng)；③MSC組：’BMSCs與HSCs共培養(yǎng)；④C-met抗體預(yù)處理組：兔抗C-met多克隆抗體500ng／ml預(yù)先封閉HSCs表面C-met受體6h后,BMSCs與HSCs共培養(yǎng)。以上體系培養(yǎng)觀察24h和48 h,于倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察HSCs細(xì)胞形態(tài)；免疫組化法檢測HSCs a-SMA表達(dá)。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測共培養(yǎng)體系0h、24h、48h HSCs增殖能力；流式細(xì)胞術(shù)Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測共培養(yǎng)體系24h、48h HSCs凋亡；RT-PCR、Western blot檢測共培養(yǎng)體系0h、24h、48h HSCs內(nèi)RhoA mRNA和RhoA蛋白的表達(dá)。收集BMSCs與HSCs共培養(yǎng)、單獨(dú)BMSCs、單獨(dú)HSCs培養(yǎng)體系24h、48h時(shí)間段上清液,-80℃冰箱保存,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測共培養(yǎng)上清液中肝細(xì)胞生長因子濃度。 結(jié)果1.BMSCs對HSC增殖具有抑制作用,BMSCs與HSCs共培養(yǎng)后24h、48h的HSCs增殖抑制率分別為(12.21±2.55)%與(35.43±6.17)%。BMSCs在24h已抑制大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖,48h明顯抑制大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。MSCs組與空白對照組、實(shí)驗(yàn)對照組和C-met抗體預(yù)處理組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。2.BMSCs與HSCs共培養(yǎng)24h、48h后HSCs的凋亡率分別為(7.20±1.70)%與(25.80±3.60)%,BMSCs明顯促進(jìn)24h、48h時(shí)間段大鼠肝星狀細(xì)胞的凋亡,與空白對照組、實(shí)驗(yàn)對照組與C-met抗體預(yù)處理組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。3.BMSCs與HSCs共培養(yǎng)后,RT-PCR法檢測共培養(yǎng)24h、48h后HSCs中RhoA mRNA表達(dá)分別為(0.68±0.08)與(0.40±0.03)。BMSC組共培養(yǎng)24h后,RhoA mRNA的表達(dá)受到抑制；48h時(shí)抑制則更為明顯,且顯著低于空白對照組、實(shí)驗(yàn)對照組與C-met抗體預(yù)處理組,與上述三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F0.01)。4. Western blotting檢測BMSCs與HSCs共培養(yǎng)24h、48h后HSCs中RhoA蛋白的表達(dá)分別為(0.76±0.06)與0.43±0.05)。BMSC組共培養(yǎng),24h后,RhoA蛋白表達(dá)即受到抑制；48h時(shí)抑制則更為明顯,且顯著低于空白對照組、實(shí)驗(yàn)對照組與C-met抗體預(yù)處理組,與上述三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。5.ELISA檢測BMSCs與HSCs共培養(yǎng)24h、48h上清液中HGF濃度分別為(250±35)pg／m1與(570±80)pg／ml,明顯高于單獨(dú)BMSCs培養(yǎng)和單獨(dú)HSC培養(yǎng),與上述2組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。 結(jié)論BMSCs與HSCs共培養(yǎng)能抑制HSCs的增殖,促進(jìn)凋亡,抑制RohA表達(dá),其機(jī)制是通過BMSCs旁分泌HGF發(fā)揮抑制大鼠肝星狀細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡和抑制RhoA表達(dá)的作用�？赡苁荁MSCs抗肝纖維化作用的分子機(jī)制之一。
【圖文】：

HGF濃度進(jìn)行檢測。BMSCS與HSCs共培養(yǎng)上清液中HGF濃度為(250士35)pg/ml與(570士80)pg/ml，明顯高于單獨(dú)BMseS培養(yǎng)和單獨(dú)HseS培養(yǎng)，，與單獨(dú)BMSCS、單獨(dú)HSCS培養(yǎng)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(只0.01)(表5，圖7)。

一nC一et抗體預(yù)處理后共培48h
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【引證文獻(xiàn)】

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1 雷香麗;佟明華;張建;王亞萍;孔祥平;;不同途徑移植大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠肝硬化的作用研究[J];華南國防醫(yī)學(xué)雜志;2012年03期

本文編號：2562991