【摘要】： 目的: 本研究運(yùn)用RT-PCR、Western blotting、免疫組織化學(xué)以及激光掃描共聚焦顯微技術(shù),檢測假孕、妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜中β-TrCP及其所降解的靶蛋白β-catenin、IκBα基因與蛋白的表達(dá)、分布規(guī)律、動態(tài)變化以及對胚胎著床的影響,有助于從分子水平探討β-TrCP在胚胎著床過程中的分子調(diào)控機(jī)制,從而為了解人類正常生殖過程機(jī)制和生殖方面疾病的診斷、治療奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.建立早孕及假孕NIH小鼠動物模型,隨機(jī)將孕鼠分為7組作為實(shí)驗(yàn)組,每組6只小鼠(其中D5需12只)。假孕小鼠作為對照組,收集妊娠D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7以及假孕小鼠子宮及內(nèi)膜組織, 80℃凍存?zhèn)溆谩?2.采用臺盼蘭尾靜脈注射法分離子宮內(nèi)膜胚胎著床點(diǎn)及其旁組織。 3.運(yùn)用RT-PCR法檢測β-TrCP mRNA、β-catenin mRNA、IκBαmRNA在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況及動態(tài)變化規(guī)律。 4.運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)以及Western blotting法檢測β-TrCP、β-catenin以及IκBα蛋白在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況及動態(tài)變化規(guī)律。 5.運(yùn)用激光掃描共聚焦顯微技術(shù)檢測胚胎著床點(diǎn)及其旁組織β-TrCP以及IκBα蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果: 1.經(jīng)尾靜脈注射臺盼蘭后,取出雙側(cè)子宮,可見條狀子宮呈現(xiàn)藍(lán)染帶。著床點(diǎn)被藍(lán)染,與非著床點(diǎn)區(qū)別明顯。 2.RT-PCR分析表明:各組小鼠子宮內(nèi)膜均有β-TrCP、β-catenin、IκBαmRNA的表達(dá),并且存在時空表達(dá)差異。在妊娠D4時,β-TrCP表達(dá)水平達(dá)到最高峰,而β-catenin、IκBα表達(dá)水平降至最低。著床位點(diǎn)β-TrCP mRNA水平比旁組織顯著增強(qiáng)(p0.05),而旁組織中IκBαmRNA水平比著床位點(diǎn)顯著增強(qiáng)(p0.05)。 3.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:β-TrCP、β-catenin、IκBα蛋白在妊娠早期以及假孕小鼠子宮中均有表達(dá)。從妊娠D1開始,β-TrCP蛋白水平逐漸升高,至著床窗口期(D4)達(dá)最高水平(p0.0l),并維持到妊娠D5(p0.05),以后其表達(dá)逐漸降低至正常水平。β-catenin、IκBα蛋白在著床前期一直維持在較高水平,與假孕對照組比較有顯著差異(p0.05),但在著床窗口期(D4)明顯降低(p0.05),之后又逐漸升高。β-TrCP蛋白主要集中在胞漿表達(dá),妊娠D1至妊娠D3主要分布于腺上皮、腔上皮,妊娠D4以后集中在基質(zhì)表達(dá)。β-catenin、IκBα蛋白在胞漿、胞核中均有表達(dá),但主要集中在基質(zhì)表達(dá),腺上皮、腔上皮表達(dá)較弱。 4.激光掃描共聚焦顯微技術(shù)分析顯示:β-TrCP、IκBα蛋白在假孕對照、胚胎著床位點(diǎn)及其旁組織中均有表達(dá)。著床位點(diǎn)、旁組織中β-TrCP、IκBα蛋白水平與假孕對照組比較有顯著差異(p0.01),著床位點(diǎn)β-TrCP的蛋白水平與旁組織相比,顯著性增高(p0.05);相反,旁組織中IκBα蛋白水平與著床位點(diǎn)相比,顯著性增高(p0.05)。β-TrCP蛋白綠色熒光陽性信號主要分布在腺上皮、腔上皮的胞漿中,基質(zhì)中亦有表達(dá)。IκBα蛋白紅色熒光陽性信號在腺上皮、腔上皮、基質(zhì)的胞漿和胞核中均有表達(dá)。 5.Western blotting顯示:各樣本均于92kDa、60kDa、50kDa、40kDa處分別出現(xiàn)β-catenin、β-TrCP、內(nèi)參Tubulin以及IκBα蛋白條帶。 結(jié)論: 1.β-TrCP、β-catenin、IκBα基因及其蛋白在假孕以及妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜中均有表達(dá),并存在時空表達(dá)差異。 2.β-TrCP作為SCF(Skp1-Cull-F-box)復(fù)合物成員之一,參與磷酸化β-catenin、IκBα的泛素化降解。β-TrCP的高水平表達(dá)勢必造成胞漿中β-catenin、IκBα的較低水平;β-TrCP為Wnt/β-catenin信號通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子和NFκB通路的正性調(diào)節(jié)因子,β-TrCP在妊娠D4、D5維持較高水平這一事實(shí)與胚胎著床窗口期Wnt/β-catenin信號通路處于抑制狀態(tài),而NFκB信號通路短暫激活相符。 3.著床點(diǎn)組織中β-TrCP蛋白水平明顯高于著床旁組織,著床位點(diǎn)子宮內(nèi)膜的變化有別于旁組織的變化,著床位點(diǎn)內(nèi)膜更利于胚胎的侵入。提示β-TrCP可能參與了胚胎著床的侵襲過程。
【圖文】：

圖1-1 總RNA電泳結(jié)果Fig. 1-1 Total RNA gel image RT-PCR檢測β-TrCPmRNA在假孕及妊娠1-7天小鼠子宮內(nèi)膜的1-2 The expression of β-TrCP mRNA in endometria oopregnancy and pregnancy D1 to D7 by RT-PCRNA marker；泳道1-7：妊娠1-7天；C：假孕NA marker; lane 1-7: RT-PCR products of mice endometria from daancy; lane C: pseudopregnancy.

RT-PCR檢測β-TrCPmRNA在假孕及妊娠1-7天小鼠子宮內(nèi)膜1-2 The expression of β-TrCP mRNA in endometriopregnancy and pregnancy D1 to D7 by RT-PCRNA marker；泳道1-7：妊娠1-7天；C：假孕NA marker; lane 1-7: RT-PCR products of mice endometria fromancy; lane C: pseudopregnancy. RT-PCR檢測β-catenin mRNA在假孕及妊娠1-7天小鼠子宮內(nèi)1-3 The expression of β-catenin mRNA in endometr
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R321

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 賴巧紅,章漢旺;Wnt信號傳導(dǎo)途徑與胚胎著床[J];國外醫(yī)學(xué)(計劃生育分冊);2005年03期

2 林振和;核因子-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);2004年04期

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本文編號：2562819