發(fā)布時(shí)間：2019-11-19 09:12

【摘要】： 目的：(1)體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。(2)通過檢測電磁場對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化指標(biāo)的影響,研究電磁場促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化的效應(yīng)。(3)研究電磁場對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂肪分化影響。(4)研究電磁場對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞信號(hào)通路的影響,并探討電磁場激活的信號(hào)通路同電磁場促成骨效應(yīng)間的聯(lián)系。 方法：用梯度離心+反復(fù)貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)和純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,取純度較高且活性良好的P4-P6代細(xì)胞作為我們研究的靶細(xì)胞。 (1)采用多向分化誘導(dǎo)和流式細(xì)胞檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物等方法對所取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定,以確定所取細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 (2)通過PNPP法檢測堿性磷酸酶活性,RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多種成骨指標(biāo)：ALP、RUNX2、BMP2、BSP、DLX5的表達(dá),免疫組化檢測Ⅰ型膠原的表達(dá),Von Kossa染色法檢測鈣結(jié)節(jié)的形成等方法探討電磁場促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的效應(yīng)。 (3)通過RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測成脂肪指標(biāo)的表達(dá)、western blot檢測PPARγ蛋白的表達(dá),油紅O染色檢測脂肪滴的形成,檢測電磁場對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪分化的影響。 (4)通過Western Blot、ELISA等方法檢測電磁場對MAPK、AKT、cAMP-PKA等信號(hào)通路的影響,找出相關(guān)激活的信號(hào)通路及作用位點(diǎn)。 (5)通過加入信號(hào)通路抑制劑或激動(dòng)劑,檢測在抑制或活化信號(hào)通路的條件下電磁場促成骨效應(yīng)的變化,探討電磁場激活的信號(hào)通路同其促成骨效應(yīng)間的聯(lián)系。 結(jié)果：(1)所取細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察呈成梭形或多角形,有較好的折光性；生長迅速,常成簇狀,集落狀生長。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用下21天后可形成大量鈣結(jié)節(jié),在成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用下14天后有大量脂肪滴的形成。流式鑒定結(jié)果顯示,CD90+,CD45-；CD29+,CD45-的表達(dá)率均在95%以上,而CD45+陽性的表達(dá)率小于5%,這表明其基本不含造血細(xì)胞系,細(xì)胞均一性良好,符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物特征。 (2)電磁場作用三天后明顯促進(jìn)堿性磷酸酶活性的表達(dá),促進(jìn)Ⅰ型膠原的表達(dá),多種成骨指標(biāo)：ALP、BMP2、DLX5、BSP、RUNX2等mRNA的表達(dá)在電磁場作用三天后表達(dá)明顯升高。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下,15天和21天鈣結(jié)節(jié)染色電磁場作用組較對照組鈣結(jié)節(jié)數(shù)目明顯增多。 (3)RT-PCR及實(shí)時(shí)定向PCR顯示電磁場作用下,成脂肪分化指標(biāo)PPAR-γ2、adipsin、AP2等mRNA下調(diào);PPAR-γ2蛋白表達(dá)下調(diào)；脂肪滴的形成減少。 (4)電磁場作用細(xì)胞15min、30min、60min、120min后檢測cAMP、PKA、ERK1/2、P38、JNK.AKT等信號(hào)通路位點(diǎn),結(jié)果顯示電磁場增加cAMP和PKA的表達(dá)；促進(jìn)磷酸化ERK1/2和P38的表達(dá)；而對JNK和AKT等磷酸化表達(dá)沒有影響。加入PKA抑制劑H-89及ERK1/2抑制劑PD98059后,檢測電磁場促成骨指標(biāo)表達(dá)變化,顯示加入通路抑制劑抑制電磁場激活的信號(hào)通路將明顯抑制電磁場的促成骨效應(yīng)。 結(jié)論： (1)通過梯度離心法+反復(fù)貼壁分離法可獲得純度較高的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 (2)電磁場可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化。 (3)電磁場抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂肪細(xì)胞分化。 (4)電磁場激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)cAMP-PKA信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路,激活的這些信號(hào)通路同電磁場促成骨分化效應(yīng)相關(guān)。
【圖文】：

在倒置顯微鏡下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成梭形或多角形，有較好的折光性;生一長迅速，常成簇狀，集落狀生長，待培養(yǎng)至7天左右，細(xì)胞即開始融合，，需予以傳代培養(yǎng)。見圖1。2.流式鑒定結(jié)果以CD90、CD45、CD29等為標(biāo)一記物雙標(biāo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，其表面標(biāo)志物鑒定結(jié)果如下圖2。流式鑒定結(jié)果顯示，CD90+，CD45~;CD29+，CD45一的表達(dá)率均在95%以上，而CD45+陽性的表達(dá)率小于5%，這表明其基本不含造血細(xì)胞系，細(xì)胞均一性良好，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)一記物特征。3.成骨分化細(xì)胞傳代培養(yǎng)

11000100Q09000800070006000500040003000200010000〔二二習(xí)對照組七22習(xí)任MF組

本文編號(hào)：2563020