發(fā)布時(shí)間：2019-11-17 12:33

【摘要】：【目的】 由于創(chuàng)傷、腫瘤、先天性畸形、感染、病理等因素造成的骨組織缺損是臨床面臨的難題之一,植骨術(shù)是解決這一問題的主要方法�，F(xiàn)階段方法的弊端或局限性主要有供源不足、供區(qū)損傷和取骨后的并發(fā)癥、移植排斥反應(yīng)等。近年來由支架材料、種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子復(fù)合構(gòu)建的組織工程骨可以改進(jìn)上述弊端,為臨床治療骨缺損的修復(fù)帶來美好的前景。本實(shí)驗(yàn)將探討腺病毒介導(dǎo)的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后對(duì)BMSCs增殖及成骨轉(zhuǎn)化的影響,在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察轉(zhuǎn)染BMP-2基因的rBMSCs在Nano-HA支架中粘附、增殖情況構(gòu)建仿生人工骨,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù),用含目的基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞復(fù)合到Nano-HA,細(xì)胞載體復(fù)合物穩(wěn)定長(zhǎng)效地分泌生長(zhǎng)因子,體外構(gòu)建了仿生人工骨,為進(jìn)一步應(yīng)用此組織工程骨修復(fù)骨缺損奠定基礎(chǔ)。 【方法】 1.取2～3月齡健康新西蘭大白兔一只,無菌條件下用18號(hào)骨髓穿刺針從脛骨結(jié)節(jié)外側(cè)穿刺抽取骨髓3～4mL,采用Percoll(1.073 g/ml)分離液分離培養(yǎng)骨髓中BMSCs細(xì)胞,留備下一步實(shí)驗(yàn)。其中少量細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,并采用成骨細(xì)胞誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基培養(yǎng),鈣鉆法檢測(cè)堿性磷酸酶表達(dá),茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成能力。 2.部分傳代培養(yǎng)的rBMSCs細(xì)胞,以腺病毒為載體攜目的基因BMP-2/GFP轉(zhuǎn)染rBMSCs,轉(zhuǎn)染后傳代培養(yǎng)備用。取部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行如下鑒定: Ad-GFP轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè),免疫組化、RT-PCR、western blot檢測(cè)Ad-BMP-2轉(zhuǎn)染后目的基因在rBMSCs的表達(dá)。 3.胰酶消化收集上述培養(yǎng)的第三代細(xì)胞及轉(zhuǎn)染48h后的第三代細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,把細(xì)胞懸液均勻接種預(yù)濕的Nano-HA材料塊,材料與細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)后第d3、d7,分別取兩組材料,通過掃描電鏡觀察材料表面細(xì)胞附著、分布、生長(zhǎng)情況。Western Blot檢測(cè)復(fù)合后細(xì)胞BMP-2蛋白的表達(dá)。 【結(jié)果】 1.原代及傳代rBMSCs均表現(xiàn)為長(zhǎng)梭形改變,呈渦旋狀、放射狀排列,連續(xù)傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)良好,使用條件培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3周后,經(jīng)誘導(dǎo)鑒定可向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,茜素紅染色陽性并形成礦化結(jié)節(jié),細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)后開始形成鈣結(jié)節(jié)。 2. Ad-BMP-2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,生長(zhǎng)旺盛,隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞體積變大由長(zhǎng)梭形向多角形改變的趨勢(shì),轉(zhuǎn)染后細(xì)胞BMP-2免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示胞漿呈陽性表達(dá);RT-PCR檢測(cè)到大小約338bp大小的陽性條帶,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞BMP-2基因不同時(shí)期mRNA水平有高表達(dá);Western-blot檢測(cè)到約30kD大小的陽性條帶,轉(zhuǎn)染后Ad-BMP-2轉(zhuǎn)染組有BMP陽性條帶,且隨時(shí)間的增長(zhǎng)條帶呈強(qiáng)陽性,而未轉(zhuǎn)染組可見較弱的條帶,病毒轉(zhuǎn)染rBMSCs細(xì)胞后在蛋白水平也有高表達(dá)。 3.復(fù)合培養(yǎng)3天后,掃描電鏡見載體表面不規(guī)則,其間可見微孔并且部分被細(xì)胞覆蓋,轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在Nano-HA材料塊陷窩和空隙中粘附良好,密集處連接成片,細(xì)胞貼附伸展良好。復(fù)合7天后細(xì)胞在材料表面完全鋪展,并伸出偽足,與材料表面融合緊密,細(xì)胞周緣可見鈣鹽分泌及沉積。提取細(xì)胞載體復(fù)合上的細(xì)胞,western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染組在第三、第五天有BMP-2蛋白有高表達(dá),轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞載體復(fù)合物可繼續(xù)分泌BMP-2。 【結(jié)論】 1.BMSCs細(xì)胞取材方便,采用密度梯度離心法能分離獲得大量實(shí)驗(yàn)用BMSCs。BMSCs培養(yǎng)性能穩(wěn)定,便于傳代擴(kuò)增,在一定誘導(dǎo)條件下可轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞,適合于作為骨組織工程的種子細(xì)胞。 2.采用GatewayTM技術(shù)構(gòu)建了攜帶hBMP-2的重組腺病毒載體,能高效轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,轉(zhuǎn)然后能夠高效、持續(xù)表達(dá)、分泌BMP-2蛋白。 3.成功體外構(gòu)建BMP-2基因強(qiáng)化的組織工程仿生人工骨。
【圖文】：

圖 1 Nano-HA 人工骨粉末Fig.1 Powder of Nano-HA artificial bone圖 3 普通 HA 人工骨Fig.3 Normal HA artificial bone圖 4 Nano-HA 人工骨于倒置顯微鏡下（×400） 圖 5 HA 人工骨于倒置顯微鏡下（×200）Fig.4 Structure of Nano-HA under invert（×400） Fig.5 Structure of HA artificial bone under microscopinvert microscope（×200）

圖 1 Nano-HA 人工骨粉末Fig.1 Powder of Nano-HA artificial bone圖 3 普通 HA 人工骨Fig.3 Normal HA artificial bone圖 4 Nano-HA 人工骨于倒置顯微鏡下（×400） 圖 5 HA 人工骨于倒置顯微鏡下（×200）Fig.4 Structure of Nano-HA under invert（×400） Fig.5 Structure of HA artificial bone under microscopinvert microscope（×200）
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2562312