【摘要】： 背景：Sonic Hedeghog (SHH)基因通過(guò)上調(diào)多種血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)來(lái)參與血管發(fā)生。內(nèi)源性的SHH途徑在發(fā)生心肌缺血后也會(huì)被激活,由于SHH基因有促進(jìn)血管新生的作用,因此SHH基因可能作為潛在的治療策略應(yīng)用于心肌缺血。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可向肌性細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化,在心肌缺血損傷后促進(jìn)新生血管形成和心肌重構(gòu),改善心功能。此外MSC還可接受多種載體的基因轉(zhuǎn)染并在體內(nèi)分化后仍可保持良好的遺傳穩(wěn)定性,故還可作為基因治療的靶細(xì)胞。 目的：研究對(duì)大鼠MSC進(jìn)行重組SHH基因修飾的可行性。為下一步基因與細(xì)胞聯(lián)合干預(yù)心肌缺血大鼠模型做好準(zhǔn)備。 方法：克隆Wistar大鼠SHH基因并測(cè)序鑒定。構(gòu)建PCDNA3.1-SHH真核表達(dá)載體,采用密度梯度離心一貼壁培養(yǎng)法獲取Wistar大鼠MSC,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD44、CD45和SH3。采用Nucleofector電轉(zhuǎn)染方法將PCDNA3.1-SHH真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至MSC,Western-Blot檢測(cè)鑒定SHH在MSC中的表達(dá)情況。 結(jié)果：RT—PCR擴(kuò)增的大鼠SHH基因編碼序列(CDS)片段,經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定與Genebank一致。采用密度梯度離心一貼壁培養(yǎng)法可獲取大鼠MSC,檢測(cè)結(jié)果CD44、SH3陽(yáng)性,CD45、CD34陰性,Western-Blot檢測(cè)證實(shí)Nucleofector方法可將SHH基因轉(zhuǎn)染進(jìn)大鼠MSC,并獲得有效表達(dá),而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的MSC未檢測(cè)到表達(dá)。 結(jié)論：重組真核表達(dá)載體PCDNA3.1-SHH可成功在大鼠MSC中表達(dá),為進(jìn)一步研究移植SHH基因修飾的MSC對(duì)心肌缺血大鼠心功能的影響提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

500250圖1一1大鼠RNA電泳圖1一 2RT一PcR擴(kuò)增SHH基因編碼序列 M:DZ000MarkerM:D2000Marker100〔圖1一 3pGEMT一SHH重組載體雙酶切圖1一 5PCDNA3.1一SHH重組 M:DZ000Marker真核表達(dá)載體雙酶切 M:D2000PlusMarker

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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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1 李德衛(wèi);深靜脈受壓與血栓形成關(guān)系的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2003年

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本文編號(hào)：2562090