【摘要】：第一部分人臍血來源CD34+內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及集落形成特性 目的：骨再生及修復中干細胞的應用是一種新興的治療策略。近年來內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells, EPCs）移植被認為是骨創(chuàng)傷及全身性骨疾�。ㄈ绻琴|(zhì)疏松、先天性的骨發(fā)育不全等）最具潛力的治療方法。但目前對EPCs的鑒定國內(nèi)外存有爭議，一種為形態(tài)上呈“紡錘樣”的內(nèi)皮細胞集落形成單元（endothelial cellcolony-forming units, CFU-ECs），另一種呈“鵝卵石樣”的內(nèi)皮克隆形成細胞（endothelial colony-forming cells, ECFCs）。本研究擬分離、培養(yǎng)及鑒定人臍血來源的CFU-ECs與ECFCs，并對其進行鑒別界定和成血管能力研究，了解兩者的生物學差異。 方法： 1.收集健康新生產(chǎn)婦臍血，肝素抗凝，用等量的PBS稀釋，離心后取中間白膜層，用Easysep免疫磁珠（MACS）人CD34細胞正選試劑篩選。 2.應用流式細胞術對比ECFCs和CFU-ECs兩種細胞表面抗原的表達差異性。 3.以EPCs的標志性基因為引物，應用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(Reverse transcriptionPCR, RT-PCR)技術對比兩種細胞基因水平差異。 4.應用細胞免疫熒光檢測兩種細胞表面標志分子蛋白水平的表達。 5.Dil-Ac-LDL攝取、集落形成及細胞成血管實驗等多種方法對比兩類細胞功能方面的差異性。 結(jié)果： 通過流式檢測發(fā)現(xiàn)ECFCs和CFU-ECs表達相同內(nèi)皮細胞表面抗原，如 VEGER-2、CD31、CD144、CD105和CD146。而CD45和CD14在兩者的表達存在 明顯差異，CFU-ECs表面強表達，ECFCs表面幾乎檢測不到�；蛩健⒌鞍姿� 也證明上述結(jié)論。另外兩者在集落形態(tài)、細胞增殖能力、Dil-Ac-LDL攝取和體外成血管能力等方面均存在明顯差異；ECFCs可見多個散在“鵝卵石樣”集落形成，而CFU-ECs為梭形細胞排列呈放射狀，細胞功能方面ECFCs在攝食Dil-AC-LDL，成血管方面作用明顯，而CFU-ECs卻沒有這些細胞功能。 結(jié)論： CFU-ECs可能是造血干細胞源性的細胞集落，并非真正的EPCs。而ECFCs具有很好的成血管能力，為真正意義上的EPCs，在組織工程和臨床等方面有極大的應用 前景。 第二部分重組巖藻糖級轉(zhuǎn)移酶VI過表達對內(nèi)皮祖細胞歸巢能力影響的研究 目的：近年來研究發(fā)現(xiàn)EPCs在促進裸鼠骨折愈合及骨痂形成方面有顯著效果。EPCs用于骨折治療的關鍵環(huán)節(jié)是其必須定向歸巢到缺血骨折區(qū)域，EPCs滾動、粘附、歸巢到損傷部位是由P-選擇素(P-Selectin)和E-選擇素(E-selectin)與其共同的配體P-選擇素糖蛋白配體(P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1)的相互作用介導的；據(jù)Hidalgo發(fā)現(xiàn)干細胞的PSGL-1不能有效地與P-Selectin和E-selectin結(jié)合，但細胞的體外糖基化可以明顯提高PSGL-1與選擇素的結(jié)合能力，如果通過糖基化修飾能夠修正EPCs的這一功能缺陷，將會大大提高EPCs的歸巢能力和骨疾病的治療價值。 方法： 1.用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pPROTA-TA為載體的人巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α1-3fucosyl-transferase VI, FTVI)表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EPCs。 2.轉(zhuǎn)染48h后用流式細胞儀檢測EPCs表面sLex結(jié)構(gòu)，驗證細胞表面糖基化效率。 3.采用流式細胞儀分析EPCs、糖基化處理的EPCs(fucosytransferase VI treatedEPCs, FUT-EPCs)與P-Selectin的結(jié)合率。 4.在裸鼠股骨中段骨折模型中將PBS (contorl組)、EPCs（正常組）、FUT-EPCs （實驗組）分別注入骨折裸鼠尾靜脈；通過組織切片對比三組EPCs的歸巢能力。 結(jié)果：1.流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染48h后EPCs、FUT-EPCs的sLe~x結(jié)構(gòu)率，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染 效率由未轉(zhuǎn)染前的4.8%上升到32%以上，且未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞凋亡。2.流式結(jié)果檢測EPCs、FUT-EPCs與P-Selectin的結(jié)合率；EPCs為5%，F(xiàn)UT-EPCs 上升為19%。3.裸鼠骨折局部軟組織切片；HE染色、免疫組化及組織免疫熒光結(jié)果顯示，骨折區(qū)域的血管腔及內(nèi)皮可見人EPCs的特異標志蛋白，三組中FUT-EPCs組局部EPCs 特異蛋白表達水平顯著高于其他各組。 結(jié)論：FUT-VI基因過表達可上調(diào)EPCs表面sLe~x表達，促進EPCs和選擇素的結(jié)合，從而提高EPCs在裸鼠骨折局部的歸巢能力，促進骨折愈合。
【圖文】：

圖 1 ECFCs 和 CFU-ECs 的分離和培養(yǎng) CD34+內(nèi)皮祖細胞的鑒定式細胞儀分析（Flow Cytometric Analysis）收集 9×1×105個培養(yǎng)的四代 ECFCs 和 CFU-ECs，1000 rpm 離心 ，1000 rpm 離心 5 min；棄上清，每管加入 100 μL1%BSA 室溫一遍，1000 rpm，1000 rpm 離心 5 min；棄上清，將兩種細胞分只樣品管，兩組樣品管依次加入 H2O、VEGER2-PE、CD31-PE、C、CD105-FITC、CD146-FITC、CD14-FITC、CD45-PerCP（用含液按 1:100 稀釋）；對照管加入 100 μL0.1%BSA；用流式細胞美國 BD 公司）檢測細胞表面分子標記，每個樣本收集分析 100疫熒光染色（Immunofluorescence Staining）把 3.5cm2蓋玻片用酒精燈燒灼滅菌，放入 3.8cm212 孔板內(nèi)入，分

圖 2 CFU-ECs 和 ECFCs 的細胞集落形成能力, Bar=100 μm.3.2 流式、細胞免疫熒光及 RT-PCR流式結(jié)果發(fā)現(xiàn) ECFCs 和 CFU-ECs 共同表達部分內(nèi)皮細胞表面標志，如 C05、CD146 和 VEGFR-2 等內(nèi)皮標志, 結(jié)果見圖 3A。但 CFU-ECs 表面造血志 CD45 和吞噬細胞標志 CD14 高表達；ECFCs CD34 陽性率達 75%，而 CF率為 9%；CD14 及 CD45 陽性率較低，分別為 5 %和 9 %，（圖 3B）。A
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363

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本文編號：2561789