【摘要】：第一部分人臍血來源CD34+內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及集落形成特性 目的：骨再生及修復(fù)中干細(xì)胞的應(yīng)用是一種新興的治療策略。近年來內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells, EPCs）移植被認(rèn)為是骨創(chuàng)傷及全身性骨疾�。ㄈ绻琴|(zhì)疏松、先天性的骨發(fā)育不全等）最具潛力的治療方法。但目前對EPCs的鑒定國內(nèi)外存有爭議，一種為形態(tài)上呈“紡錘樣”的內(nèi)皮細(xì)胞集落形成單元（endothelial cellcolony-forming units, CFU-ECs），另一種呈“鵝卵石樣”的內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞（endothelial colony-forming cells, ECFCs）。本研究擬分離、培養(yǎng)及鑒定人臍血來源的CFU-ECs與ECFCs，并對其進(jìn)行鑒別界定和成血管能力研究，了解兩者的生物學(xué)差異。 方法： 1.收集健康新生產(chǎn)婦臍血，肝素抗凝，用等量的PBS稀釋，離心后取中間白膜層，用Easysep免疫磁珠（MACS）人CD34細(xì)胞正選試劑篩選。 2.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對比ECFCs和CFU-ECs兩種細(xì)胞表面抗原的表達(dá)差異性。 3.以EPCs的標(biāo)志性基因?yàn)橐�，�?yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcriptionPCR, RT-PCR)技術(shù)對比兩種細(xì)胞基因水平差異。 4.應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光檢測兩種細(xì)胞表面標(biāo)志分子蛋白水平的表達(dá)。 5.Dil-Ac-LDL攝取、集落形成及細(xì)胞成血管實(shí)驗(yàn)等多種方法對比兩類細(xì)胞功能方面的差異性。 結(jié)果： 通過流式檢測發(fā)現(xiàn)ECFCs和CFU-ECs表達(dá)相同內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原，如 VEGER-2、CD31、CD144、CD105和CD146。而CD45和CD14在兩者的表達(dá)存在 明顯差異，CFU-ECs表面強(qiáng)表達(dá)，ECFCs表面幾乎檢測不到�；蛩�、蛋白水平 也證明上述結(jié)論。另外兩者在集落形態(tài)、細(xì)胞增殖能力、Dil-Ac-LDL攝取和體外成血管能力等方面均存在明顯差異；ECFCs可見多個(gè)散在“鵝卵石樣”集落形成，而CFU-ECs為梭形細(xì)胞排列呈放射狀，細(xì)胞功能方面ECFCs在攝食Dil-AC-LDL，成血管方面作用明顯，而CFU-ECs卻沒有這些細(xì)胞功能。 結(jié)論： CFU-ECs可能是造血干細(xì)胞源性的細(xì)胞集落，并非真正的EPCs。而ECFCs具有很好的成血管能力，為真正意義上的EPCs，在組織工程和臨床等方面有極大的應(yīng)用 前景。 第二部分重組巖藻糖級轉(zhuǎn)移酶VI過表達(dá)對內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢能力影響的研究 目的：近年來研究發(fā)現(xiàn)EPCs在促進(jìn)裸鼠骨折愈合及骨痂形成方面有顯著效果。EPCs用于骨折治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是其必須定向歸巢到缺血骨折區(qū)域，EPCs滾動、粘附、歸巢到損傷部位是由P-選擇素(P-Selectin)和E-選擇素(E-selectin)與其共同的配體P-選擇素糖蛋白配體(P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1)的相互作用介導(dǎo)的；據(jù)Hidalgo發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞的PSGL-1不能有效地與P-Selectin和E-selectin結(jié)合，但細(xì)胞的體外糖基化可以明顯提高PSGL-1與選擇素的結(jié)合能力，如果通過糖基化修飾能夠修正EPCs的這一功能缺陷，將會大大提高EPCs的歸巢能力和骨疾病的治療價(jià)值。 方法： 1.用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pPROTA-TA為載體的人巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α1-3fucosyl-transferase VI, FTVI)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EPCs。 2.轉(zhuǎn)染48h后用流式細(xì)胞儀檢測EPCs表面sLex結(jié)構(gòu)，驗(yàn)證細(xì)胞表面糖基化效率。 3.采用流式細(xì)胞儀分析EPCs、糖基化處理的EPCs(fucosytransferase VI treatedEPCs, FUT-EPCs)與P-Selectin的結(jié)合率。 4.在裸鼠股骨中段骨折模型中將PBS (contorl組)、EPCs（正常組）、FUT-EPCs （實(shí)驗(yàn)組）分別注入骨折裸鼠尾靜脈；通過組織切片對比三組EPCs的歸巢能力。 結(jié)果：1.流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染48h后EPCs、FUT-EPCs的sLe~x結(jié)構(gòu)率，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染 效率由未轉(zhuǎn)染前的4.8%上升到32%以上，且未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。2.流式結(jié)果檢測EPCs、FUT-EPCs與P-Selectin的結(jié)合率；EPCs為5%，F(xiàn)UT-EPCs 上升為19%。3.裸鼠骨折局部軟組織切片；HE染色、免疫組化及組織免疫熒光結(jié)果顯示，骨折區(qū)域的血管腔及內(nèi)皮可見人EPCs的特異標(biāo)志蛋白，三組中FUT-EPCs組局部EPCs 特異蛋白表達(dá)水平顯著高于其他各組。 結(jié)論：FUT-VI基因過表達(dá)可上調(diào)EPCs表面sLe~x表達(dá)，促進(jìn)EPCs和選擇素的結(jié)合，從而提高EPCs在裸鼠骨折局部的歸巢能力，促進(jìn)骨折愈合。
【圖文】：

圖 1 ECFCs 和 CFU-ECs 的分離和培養(yǎng) CD34+內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定式細(xì)胞儀分析（Flow Cytometric Analysis）收集 9×1×105個(gè)培養(yǎng)的四代 ECFCs 和 CFU-ECs，1000 rpm 離心 ，1000 rpm 離心 5 min；棄上清，每管加入 100 μL1%BSA 室溫一遍，1000 rpm，1000 rpm 離心 5 min；棄上清，將兩種細(xì)胞分只樣品管，兩組樣品管依次加入 H2O、VEGER2-PE、CD31-PE、C、CD105-FITC、CD146-FITC、CD14-FITC、CD45-PerCP（用含液按 1:100 稀釋）；對照管加入 100 μL0.1%BSA；用流式細(xì)胞美國 BD 公司）檢測細(xì)胞表面分子標(biāo)記，每個(gè)樣本收集分析 100疫熒光染色（Immunofluorescence Staining）把 3.5cm2蓋玻片用酒精燈燒灼滅菌，放入 3.8cm212 孔板內(nèi)入，分

圖 2 CFU-ECs 和 ECFCs 的細(xì)胞集落形成能力, Bar=100 μm.3.2 流式、細(xì)胞免疫熒光及 RT-PCR流式結(jié)果發(fā)現(xiàn) ECFCs 和 CFU-ECs 共同表達(dá)部分內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志，如 C05、CD146 和 VEGFR-2 等內(nèi)皮標(biāo)志, 結(jié)果見圖 3A。但 CFU-ECs 表面造血志 CD45 和吞噬細(xì)胞標(biāo)志 CD14 高表達(dá)；ECFCs CD34 陽性率達(dá) 75%，而 CF率為 9%；CD14 及 CD45 陽性率較低，分別為 5 %和 9 %，（圖 3B）。A
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363

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本文編號：2561789