【摘要】： 目的腸道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)是手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD)的主要病原體之一,且常并發(fā)多種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,甚至導(dǎo)致患者死亡。目前對(duì)EV71重癥感染尚無有效的預(yù)防與治療手段。本研究采用從六安地區(qū)手足口病患兒標(biāo)本中分離病毒的方法得到EV71地方流行株;再采用分子生物學(xué)技術(shù)以該地方株的基因組為模板,擴(kuò)增EV71衣殼蛋白VP1基因全長(zhǎng),構(gòu)建VP1基因的重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)"VP1,轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞并表達(dá);通過肌肉注射免疫BALB"c小鼠,觀察pcDNA3.1(+)"VP1誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平,為預(yù)防EV71感染尋找新的有效途徑。 方法本研究主要分為三部分內(nèi)容:⑴EV71地方株的分離與鑒定:首先將采自33例臨床診斷為手足口病的患兒的51份標(biāo)本(其中咽拭子33份,皰疹液12份,腦脊液6份)接種Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。將分離得到的可疑病毒株利用透射電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,用EV71型特異性免疫血清及型特異性引物分別進(jìn)行中和試驗(yàn)及RT-PCR檢測(cè),以對(duì)分離物進(jìn)行EV71型別鑒定;⑵VP1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建:提取分離并經(jīng)鑒定證實(shí)為EV71的1株地方株19-Luan-CHN-08的基因組RNA,以其為模板采用RT-PCR法擴(kuò)增VP1基因片段全長(zhǎng),將其插入至pMD18-T simple克隆載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性克隆,進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定及序列測(cè)定。并將序列與EV71 BrCr株VP1基因序列比較其同源性。將測(cè)序正確的VP1基因克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+),命名為pcDNA3.1(+)"VP1,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性克隆,進(jìn)行PCR鑒定及酶切鑒定。將pcDNA3.1(+)"VP1轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,用Western blot法和RT-PCR法檢測(cè)VP1基因在COS-7細(xì)胞中的表達(dá);⑶重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)"VP1的免疫活性初步研究:將pcDNA3.1(+)"VP1免疫18只6-8周齡BALB"c小鼠,共免疫三次,小鼠隨機(jī)分為A, B和C 3組,每組6只,其中A組為實(shí)驗(yàn)組,每只小鼠分別在第0、2和4周經(jīng)雙后肢股四頭肌注射pcDNA3.1(+)"VP1重組質(zhì)粒DNA 100μg,B組為空載體陰性對(duì)照組,每只小鼠分別在第0、2和4周經(jīng)雙后肢股四頭肌注射pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒100μg,C組為PBS空白對(duì)照組,每只小鼠分別在第0、2和4周經(jīng)雙后肢股四頭肌注射無菌PBS 100μl。每次免疫前24h,于每只小鼠雙后肢股四頭肌注射0.75%鹽酸布比卡因30μl。分別于每次免疫前經(jīng)鼠尾靜脈采血收集血清,末次免疫后的第2周眼眶取血收集血清并處死小鼠,取各組小鼠脾細(xì)胞。間接ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清中的特異性EV71 VP1抗體水平,中和試驗(yàn)檢測(cè)其抗EV71的中和效應(yīng),MTT比色法測(cè)定T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)以檢測(cè)細(xì)胞免疫水平。 結(jié)果⑴本次研究中,14例患兒咽拭子標(biāo)本分離陽性,陽性率為42.4%(14/33),其中2例患兒的皰疹液標(biāo)本同時(shí)陽性,陽性率16.7%(2/12),共分離培養(yǎng)得到14株病毒分離株。透射電鏡觀察,在Vero細(xì)胞胞漿內(nèi)可見有直徑約30nm的球形無包膜腸道病毒樣顆粒;而中和試驗(yàn)及型特異性引物RT-PCR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)其中6株為EV71,分別命名為01-Luan-CHN-08、06-Luan-CHN-08、11-Luan- CHN-08、13- Luan-CHN-08、14-Luan-CHN-08和19-Luan-CHN-08;⑵成功克隆了VP1基因片段全長(zhǎng),測(cè)序結(jié)果表明與EV71 BrCr株RNA同源性達(dá)98.4%,氨基酸同源性達(dá)96.3%。將此VP1基因片段與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)連接,構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)"VP1,RT-PCR檢測(cè)到VP1 mRNA表達(dá),Western blot檢測(cè)表明pcDNA3.1(+)"VP1轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞裂解液中出現(xiàn)一條約34KD的蛋白條帶,與EV71 VP1蛋白分子量一致,其可被EV71 VP1多克隆抗體特異性識(shí)別;⑶在用pcDNA3.1(+)"VP1免疫的BALB"c小鼠血清中,初次免疫后2周特異性IgG抗體水平即有明顯增高,OD450值為0.218,以后隨免疫次數(shù)增加而逐漸增高,末次免疫后2周OD450值為0.559,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,與B組及C組比較差異有顯著性(p 0.01);中和試驗(yàn)結(jié)果顯示pcDNA3.1(+)"VP1免疫的BALB"c小鼠血清可在體外對(duì)EV71產(chǎn)生中和效應(yīng);三次免疫后,脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)測(cè)定,A組小鼠T淋巴細(xì)胞增殖活性升高,刺激指數(shù)分別為:A組(2.410±0.12)、B組(1.400±0.21)、C組(1.241±0.19),A組與B組及C組比較差異有顯著性(p0.01)。 結(jié)論⑴EV71是此次六安地區(qū)HFMD主要病原體之一,采用Vero細(xì)胞株培養(yǎng)可對(duì)其進(jìn)行有效分離,其中咽拭子標(biāo)本陽性分離率最高,其次為皰疹液標(biāo)本,腦脊液標(biāo)本陽性分離率最低;⑵成功構(gòu)建了EV71地方分離株VP1重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)"VP1,并證實(shí)該重組載體在COS-7細(xì)胞中獲得表達(dá),且表達(dá)產(chǎn)物具有抗原性;⑶小鼠注射重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)"VP1后可獲得一定程度的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,免疫小鼠血清可中和EV71病毒,抑制其致細(xì)胞病變效應(yīng)。本研究為進(jìn)一步研制EV71核酸疫苗奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),將有助于對(duì)EV71感染的預(yù)防與控制。
【圖文】：

圖 1 咽拭子標(biāo)本病毒分離結(jié)果 (未染色，，×100)Fig 1 The results of virus isolation of throat swab(not stain, ×100)A：正常 Vero 細(xì)胞 A：Normal Vero cellB：咽拭子標(biāo)本引起的 Vero 細(xì)胞病變效應(yīng)B：CPE on Vero cell infected with throat swab表 1 不同標(biāo)本病毒分離結(jié)果Tab 1 The results of virus isolation of different samples標(biāo)本來源 總份數(shù) 陽性份數(shù) 陽性率（%）咽拭子 33 14 42.4皰疹液 12 2 16.7腦脊液 6 0 0.0

射電鏡下觀察 Vero 細(xì)胞胞漿中的病毒顆粒（pellets in Vero cell by transmission electron micros和試驗(yàn)（固定抗血清-稀釋病毒法）鑒定病毒分e results of neutralization test (Fixed anti-serum-d病D50陰性血清組病毒CCID50lg(抗血清組病毒毒810-7210-7.3810-7110-6.8210-7810-6.9810-6.7810-6.86-7.5
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2561718