【摘要】： 目的：建立小鼠肝竇狀內(nèi)皮細胞(sinusoidal endothelial cells, SEC)的分離培養(yǎng)方法,研究其生物學特性。 方法：中性蛋白酶(dispase)消化小鼠肝組織,Percoll密度梯度離心分離消化后的細胞懸液,用內(nèi)皮細胞選擇培養(yǎng)基及酶差異消化法純化SEC；免疫細胞化學染色檢測SEC的表面標志,電鏡分析SEC的超微結(jié)構(gòu),觀察DiI熒光標記的乙酰低密度脂蛋白(Acetylated-Low Density Lipoprotein, DiI-Ac-LDL)攝取能力以及體外成血管能力分析SEC的功能。 結(jié)果：分離純化后的細胞呈典型鵝卵石樣內(nèi)皮細胞形態(tài),這些細胞表達內(nèi)皮細胞特征性標志vWF,但不表達CD31以及間質(zhì)細胞和上皮細胞的表面標志,具有竇狀內(nèi)皮細胞特征性的窗孔結(jié)構(gòu),Weibel-Palade小體；能攝取DiI-Ac-LDL,并有一定的成血管能力。 結(jié)論：建立了一種分離、培養(yǎng)SEC的方法,為研究SEC的功能奠定了基礎。 目的：研究自發(fā)永生化肝竇狀內(nèi)皮細胞生物學特性 方法：5-溴-4氯-3-吲哚基-β-d-半乳糖苷(X-gal)染色檢測衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(senescence-associated (3-galactosidase SA-(3-Gal)活性。免疫細胞化學染色和流式細胞術(shù)檢測永生化SEC的表面標志,細胞生長曲線分析永生化SEC的增殖能力。DiI標記的乙�；兔芏戎鞍�(Acetylated-Low Density Lipoprotein, DiI-Ac-LDL)攝取能力、體外成血管能力分析永生化SEC的功能。染色體核型分析永生化SEC遺傳穩(wěn)定性；軟瓊脂體外培養(yǎng)、SCID小鼠體內(nèi)接種觀察永生化SEC體內(nèi)外成瘤性,Western blot分析永生化SEC P53蛋白表達水平的改變。 結(jié)果：在體外培養(yǎng)8代后,SEC發(fā)生衰老。衰老細胞繼續(xù)培養(yǎng)約40天左右,衰老細胞層上出現(xiàn)新的圓形、折光性強的新生細胞,這些細胞呈克隆性、多層生長,且隨傳代次數(shù)的增加,增殖能力增強,與永生化細胞特性一致。表達內(nèi)皮細胞特征性標志物vWF和CD31,也表達間質(zhì)細胞標志CD90、CD105和desmin;能攝取DiI-Ac-LDL,但失去成血管能力；體內(nèi)外均無成瘤性,P53蛋白表達明顯增加。 結(jié)論：肝竇狀內(nèi)皮細胞在體外培養(yǎng)條件下自發(fā)永生化。
【圖文】：

爆口杏·_、圖1一 1SEC的形態(tài)特征注:圖1一 1sEc的形態(tài)(x100)。A:原代sEc的細胞形態(tài);B:純化sEc細胞形態(tài)。圖1一 2sEC免疫表型分析注:A:vwF免疫細胞化學染色 (x400);B:CD31免疫熒光染色(cD31，綠色;I)Apl，藍色)(X20o);C:CK19免疫熒光染色(CK19，，綠色;DApl，藍色)(xZoo);x):eD90免疫熒光染色(CD90，綠色;DApl，藍色 )(X200);E:CDIOS免疫熒光染色‘CD105，綠色;DAPI

碩l一‘學位論文附l冬]圖1一 3SEC吞噬Ac一LDL熒光結(jié)果份i:SEC攝取DII一Ae一 IJDL(X100)。A:f)API(、流色):B:細胞攝取DII一Ae一LDL(爹，色);C:A干 1IB合j戊。碑豁蓋一歲熟‘產(chǎn)聲節(jié)一叮一釁;/:一認_…健口心亙庵翻.吞‘也圖1一 4SEC體外成血管實驗結(jié)果八:S盯體外形成而一竹的能力(X40)。A:4h細胞形成山L管結(jié)構(gòu);11:(ih細胞形成血管結(jié)構(gòu);〔’:I()h紅f}胞形成If!!_乍育·結(jié)構(gòu):f〕:12h紅{{j泡形j戊If{}牛竅二爹，，，構(gòu):E:14h細胞形j戊血管結(jié)構(gòu):F:陽性對照內(nèi)皮fll_細胞4h!}寸形成而管結(jié)構(gòu)。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻】

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