【摘要】：目的驗證肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)糖酵解關(guān)鍵酶三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和熱休克蛋白Dna J的相互作用。方法 PCR擴(kuò)增S.pn D39 GAPDH蛋白編碼基因gap全長,將其克隆至p ET-28a(+),重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)GAPDH-6His的表達(dá),經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后,用SDS-PAGE鑒定其純度。重組GAPDH蛋白經(jīng)腹部皮下免疫昆明小鼠獲得多克隆抗體。Western blot鑒定GAPDH的保守性。采用大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)、直接結(jié)合實驗、生物膜層干涉技術(shù)(Bio-layer Interferometry,BLI)驗證GAPDH和Dna J的相互作用。結(jié)果獲得了純度達(dá)90%的GAPDH重組蛋白,并獲得了效價達(dá)107的抗GAPDH多克隆抗體,Western blot檢測顯示在7株不同血清型S.pn的全菌裂解液和培養(yǎng)上清中均存在和抗GAPDH抗體反應(yīng)的特異性條帶。大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)顯示GAPDH和Dna J共轉(zhuǎn)化菌株能夠在3-AT平板及雙選擇培養(yǎng)平板上生長,提示二者在細(xì)菌胞內(nèi)有相互作用。直接結(jié)合實驗和BLI顯示隨著加入GAPDH蛋白濃度的增加,二者的結(jié)合量也增加,提示GAPDH和Dna J的結(jié)合具有濃度依賴性。BLI實驗也顯示GAPDH和Dna J的親和常數(shù)為1.12×10-7mol/L。結(jié)論糖酵解關(guān)鍵酶GAPDH在肺炎鏈球菌中保守表達(dá),且為分泌性蛋白;該蛋白和熱休克蛋白Dna J在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用,且為直接相互作用。
【圖文】：

p→500bp→250bp→100bp→M12000bp→1000bp→750bp→500bp→250bp→100bp→M122000bp→1000bp→750bp→500bp→250bp→100bp→ABCDEFG←1008bp←4400bp←1008bp←1119bp←1008bpA:靶質(zhì)粒pTＲG-gapPCＲ擴(kuò)增M:DL2000標(biāo)準(zhǔn);1:靶質(zhì)粒pTＲG-gapPCＲ擴(kuò)增產(chǎn)物;B:靶質(zhì)粒pTＲG-gapBamHⅠ及XhoⅠ雙酶切M:DL2000標(biāo)準(zhǔn);1:靶質(zhì)粒pTＲG-gapBamHⅠ及XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物;C:靶質(zhì)粒pTＲG-gap及誘餌質(zhì)粒pBT-dnaJ共轉(zhuǎn)化E．coliXL1-BlueMＲF'KanPCＲ鑒定M:DL2000標(biāo)準(zhǔn);1:gap擴(kuò)增產(chǎn)物;2:dnaJ擴(kuò)增產(chǎn)物;D:平板示意圖1:實驗組共轉(zhuǎn)化菌;2:系統(tǒng)自帶陽性對照共轉(zhuǎn)化菌;3:已知陽性對照共轉(zhuǎn)化菌;4:陰性對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化菌;5:陰性對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化菌;E:非選擇平板(含Tet，，Cam);F:3-AT平板(含Tet、Cam、3-AT);G:雙選擇平板(含Tet、Cam、3-AT、Strep)圖4大腸桿菌雙雜交驗證GAPDH和DnaJ的相互作用1633第37卷第16期2015年8月30日第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報JThirdMilMedUnivVol．37，No．16Aug．302015

2.01.51.00.50D（450）值00.6251.252.55.010.0DnaJ+GAPDHBSA+GAPDHGAPDH（μg）圖5直接結(jié)合實驗驗證GAPDH和DnaJ的相互作用2．7BLI驗證GAPDH和DnaJ的相互作用在300s之前，GAPDH和DnaJ的結(jié)合呈濃度梯度依賴的關(guān)系，隨著GAPDH濃度的增加，二者結(jié)合增加，與直接結(jié)合實驗結(jié)果一致。在300s之后，開始緩慢解離，最后達(dá)到結(jié)合解離平衡(圖6)。通過octeＲED96分子互作儀相對應(yīng)軟件計算二者相互作用參數(shù)，得出GAPDH和DnaJ相互作用的結(jié)合常數(shù)達(dá)2．91×103(mol·s)－1，解離常數(shù)達(dá)3．25×10－4s－1，親和常數(shù)達(dá)到了1．12×10－7mol/L，說明二者具有較強(qiáng)的結(jié)合力和較高的親和力，再次證明GAPDH和DnaJ具有直接的相互作用。0.800.750.700.650.550.500.450.400.350.300.250.200.150.100.050GAPDH結(jié)合量(nmol)050100150200250300350400450500550600650700時間（t/s）4.8μmol2.4μmol1.2μmol0.6μmol0μmol圖6BLI驗證GAPDH和DnaJ的相互作用3討論蛋白相互作用的驗證是進(jìn)行其功能研究的基矗我們前期研究顯示，DnaJ可能參與GAPDH的非經(jīng)典分泌［15］，需要確證二者是否有相互作用。目前有多種鑒定蛋白相互作用的方法，包括酵母雙雜交系統(tǒng)、細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)、免疫共沉淀、直接結(jié)合實驗、BLI等，在進(jìn)行相互作用研究時需要根據(jù)實情進(jìn)行考慮。酵母雙雜交系統(tǒng)是基于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的作用原理而建立的［18］。細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)是利用轉(zhuǎn)錄激活的原理檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用，能在活體內(nèi)鑒定蛋白質(zhì)的相互作用，具有高度敏感性，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能檢測到的優(yōu)點(diǎn)。與酵母雙雜交相比，細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率顯著高于酵母

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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【相似文獻(xiàn)】

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本文編號：2560551