【摘要】： 宿主細(xì)胞蛋白是生物體產(chǎn)生的與重組藥物無關(guān)的蛋白成分。為定量分析CHO細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白藥物中的殘留宿主細(xì)胞蛋白,本文采用凍融法制備了中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞可溶性細(xì)胞蛋白,分別免疫雞、兔和羊三種動物獲得高免雞蛋和抗血清。ELISA檢測水稀釋蛋黃上清,摸索抗體水平消長規(guī)律并篩選高效價雞蛋。采用水稀釋雞蛋卵黃,結(jié)合60%冰乙醇和25%冰乙醇兩步沉淀法純化雞抗CHO細(xì)胞蛋白IgY。瓊脂免疫雙擴散和ELISA檢測純化的雞IgY和兔羊血清效價,Western blot檢測三種抗體與CHO細(xì)胞蛋白的覆蓋度。選取效價高、覆蓋度高的兔羊血清,分別用辛酸硫酸銨沉淀,蛋白A／G親和純化和抗原偶聯(lián)親和純化三種方法進行純化,SDS-PAGE鑒定抗體純度,ELISA檢測抗體效價變化。同時用胃蛋白酶水解兔羊IgG獲得F(ab’)2,并用凝膠過濾純化。采用改良過碘酸鈉法標(biāo)記抗體并凝膠過濾純化。最后,用制備的抗體和酶標(biāo)記物摸索ELISA檢測CHOHCP的方法。 純化后的雞IgY和免疫后獲得的最高效價兔羊血清ELISA效價分別為104,107,106,兔羊血清瓊脂免疫雙擴散效價分別為1：128和1:32。Western blotting結(jié)果表明兔羊血清對免疫原覆蓋度高,雞抗CHO細(xì)胞蛋白IgY覆蓋度差。純化后雞IgY的SDS-PAGE純度可達(dá)99%。兔羊血清經(jīng)辛酸硫酸銨沉淀后抗體純度分別為64.7%和61.6%；辛酸硫酸銨沉淀純化后的兔羊IgG再經(jīng)蛋白A／G親和純化后,純度分別為81.3%和83.5%。蛋白A／G親和純化后抗體效價下降了約1個數(shù)量級。兔羊血清經(jīng)抗原偶聯(lián)親和純化后,特異性抗體比例增加,SDS-PAGE顯示純度分別為68.3%,和80.6%。胃蛋白酶水解制備的兔和羊F(ab’)2純度分別為65.6%和71.2%。兔IgG和羊IgG的標(biāo)記率分別為39.4%和55.4%,克分子比值分別為1.58和1.716。間接ELISA檢測線性范圍為19.53-1250ng/mL,夾心ELISA檢測靈敏度達(dá)78.13ng/mL。 已成功制備高效價抗CHO HCP的兔血清和羊血清,并分別進行了純化。ELISA檢測CHO HCP的方法還有待進一步摸索。
【圖文】：

1.2cHO細(xì)胞可溶性蛋白鑒定 CHOHCP經(jīng)SDS一PAGE凝膠電泳后，顯示是一典型的混合蛋白，，可清晰分辨的條帶達(dá)五十余條。分子量范圍跨度從IOK一25OK(見圖2)。

2純化雞IgY純度鑒定選取篩選的ELISA高效價雞蛋進行水稀釋，然后分別用印%冰乙醇和25%冰乙醇沉淀后，純度有了顯著提高，還原505一隊G〔顯示有兩條帶(見圖3)，分子 123MkD嘛、赫250蝙 130毓豁100釉辮70蘸涵553525圖3純化IgY的SDS一PAGE Fig3SDS一 PAGEofPurifiedIgYM.預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn);1.水稀釋蛋黃上清;2.水溶性蛋白組分(wSF);3.純化后IgY;
【學(xué)位授予單位】：武漢生物制品研究所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2560423