【摘要】：肽抗生素(Peptide antibiotics)為生物體基因編碼的小肽,通常由12～60個氨基酸殘基構(gòu)成,分子量小于5kDa。它們在動、植物中的廣泛分布,提示其在生物體的生長及抗感染中發(fā)揮重要作用。雖然發(fā)現(xiàn)了一些陰離子型肽抗生素,但絕大多數(shù)肽抗生素為陽離子型。如動物的防御素(Defensins)即為一組陽離子型肽抗生素,它首先從兔的中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),而后發(fā)現(xiàn)在不同動物的巨噬細(xì)胞、小腸paneth細(xì)胞、上皮細(xì)胞中也有表達(dá),具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌等多種功能。根據(jù)半胱氨酸的分布及形成二硫鍵的方式不同,哺乳動物的防御素分為α-,β-和θ-三個亞家族。人的防御素分子中均含有6個半胱氨酸,可形成3對二硫鍵。迄今已發(fā)現(xiàn)17種人防御素,包括6個α-防御素(HNP1-4,HD5和HD6)和11個β-防御素(HBD1-6和HBD25-29)。它們在人體遭受感染后,機(jī)體的特異性免疫建立之前發(fā)揮重要作用。在臨床耐藥菌問題日益嚴(yán)重、病毒感染又缺乏特異性治療手段的今天,肽抗生素的發(fā)現(xiàn)及深入研究無疑給臨床抗感染治療點(diǎn)燃了新的希望。 肽抗生素hPAB-β為人hBD-2的一種突變體,在我們的前期工作中通過刪除hBD-2N-端三個氨基酸,在C-端添加了一個天冬酰胺獲得,具有hBD-2相似的抗菌活性。在前期工作中,我們利用銅綠假單胞菌噬菌體PaP3基因編碼的PaP3.30蛋白作為承載分子對hPAB-β進(jìn)行了融合表達(dá),融合蛋白的表達(dá)率達(dá)到細(xì)菌總蛋白的40%,但該融合蛋白的分子量(23.6 kDa)是目標(biāo)肽hPAB-β(4.3 kDa)的5倍多,故實(shí)際的hPAB-β表達(dá)量不到7%,表達(dá)效率不高；后來采用串聯(lián)體的方法(即將hPAB-β基因頭尾相連,構(gòu)建不同拷貝數(shù)的表達(dá)載體),但由于一個hPAB-β中就含有6個半胱氨酸,串聯(lián)的分子越多,二硫鍵的形成越復(fù)雜,融合蛋白形成的包涵體溶解性越差,難以實(shí)現(xiàn)hPAB-β的高效制備；最后根據(jù)畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白產(chǎn)量高及可進(jìn)行分泌型表達(dá)的特點(diǎn),我們成功構(gòu)建并實(shí)現(xiàn)了肽抗生素hPAB-β在畢赤酵母中的分泌型表達(dá),目標(biāo)多肽的產(chǎn)量達(dá)到241.2±39mg／L,本論文報道了酵母高密度發(fā)酵肽抗生素hPAB-β的純化,以及在獲得高純度hPAB-β后,以單純皰疹病毒為模型,探討了hPAB-β對皰疹病毒的殺滅作用,主要實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下： 利用畢赤酵母易于高密度發(fā)酵的特性,在3.7L發(fā)酵罐中對重組了肽抗生素hPAB-β表達(dá)盒的pPIC9K-hPAB-β/GS 115酵母優(yōu)5工程菌進(jìn)行高密度發(fā)酵,在菌體達(dá)到一定生長量后,用甲醇誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá),并對菌體生長曲線、目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了監(jiān)測。從生長曲線中可見,在種子接種后的16h內(nèi),酵母菌生長迅速,加入補(bǔ)料后,酵母菌繼續(xù)生長,在生長32h(菌體濕重達(dá)236.7±25.3g／L)時停止補(bǔ)料,菌體生長速度下降,在甲醇誘導(dǎo)期間,菌體生長緩慢。在誘導(dǎo)過程中,間隔8-12h取樣進(jìn)行Tricine SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果可見,在剛開始誘導(dǎo)時,上清中未見目標(biāo)肽分泌,加入誘導(dǎo)劑12h后,隱約見有表達(dá)條帶,爾后表達(dá)帶逐漸增強(qiáng),到誘導(dǎo)60h下罐時達(dá)到最高。用Brandford法測得3次發(fā)酵液的總蛋白濃度分別為664.0 mg／L,781.8 mg／L和721.3mg／L。用Bio-Rad公司Quantity One軟件條帶檢測灰度分析工具對凝膠電泳后的蛋白條帶進(jìn)行分析,目的蛋白約占發(fā)酵上清液總蛋白的33.4%,故可知發(fā)酵上清中目的蛋白的表達(dá)量約為241.2±29.5 mg／L,實(shí)現(xiàn)了重組畢赤酵母高密度發(fā)酵表達(dá)肽抗生素hPAB-β的目標(biāo)。 純化的目的不僅僅是要獲得高純度的目標(biāo)產(chǎn)物,還要使目標(biāo)產(chǎn)物的生物學(xué)活性在純化過程中不喪失,這就要根據(jù)目標(biāo)分子與雜質(zhì)的差異設(shè)計純化路線,經(jīng)過試驗(yàn)摸索加以優(yōu)化�？紤]到hPAB-β為一陽離子小肽(pI 9.001),我們設(shè)計了10kDa膜過濾、反相層析、陽離子交換、分子篩脫鹽等純化技術(shù)對目標(biāo)肽進(jìn)行純化,最終從每升發(fā)酵液中純化得到74.9±1.5 mg目標(biāo)蛋白,純度達(dá)到98%以上,總體純化效率為31.5%,實(shí)現(xiàn)了酵母表達(dá)肽抗生素hPAB-β的分離純化。獲得純化的hPAB-β后,我們利用Western blot對目標(biāo)肽進(jìn)行了鑒定,目標(biāo)產(chǎn)物能與hPAB-β的特異性抗體反應(yīng),表明純化出的蛋白即為需要的目標(biāo)物。進(jìn)一步利用瓊脂擴(kuò)散法檢測了純化產(chǎn)物對革蘭陰、陽細(xì)菌的殺滅活性,結(jié)果表明純化產(chǎn)物具有生物學(xué)活性,為進(jìn)一步開展hPAB-β的功能研究奠定了基礎(chǔ)。 病毒分離培養(yǎng)和分型是生殖器皰疹實(shí)驗(yàn)室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,通常需時2-4天,然而不同的標(biāo)本類型對培養(yǎng)結(jié)果干擾較大。隨著基因組學(xué)的進(jìn)展,單純皰疹病毒的基因組全序列均已清楚,為分子生物診斷技術(shù)(PCR、核酸探針等)在單純皰疹病毒感染診斷中的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。為研究肽抗生素hPAB-β的抗病毒活性,我們以單純皰疹病毒為模型,采集了60例臨床上疑似生殖器皰疹患者病變部位的標(biāo)本進(jìn)行病毒分離培養(yǎng),并根據(jù)單純皰疹病毒DNA多聚酶基因序列合成了型特異性PCR引物,對臨床標(biāo)本進(jìn)行PCR檢測,并與細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了對比分析。結(jié)果60份疑為生殖器皰疹患者的標(biāo)本經(jīng)HSV型特異性PCR檢測,有45份可見約390bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物(HSV-2),陽性率75%,而HSV-1特異性引物檢測為陰性；利用Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng),結(jié)果陽性36例,陽性率60%,和PCR檢測相比,差異非常顯著(X2=24.38,P0.01)。從患者皮損的類型來看,水皰和膿皰標(biāo)本的病毒培養(yǎng)和PCR檢測陽性率均較高(80-93.3%),糜爛、結(jié)痂、斑丘疹標(biāo)本檢測陽性率較低,尤以斑丘疹最低,提示對疑為生殖器皰疹病人作病原學(xué)診斷,采集水皰、膿皰標(biāo)本進(jìn)行病毒分離或PCR檢測較佳。 利用重組畢赤酵母工程菌pPIC9k-hPAB-β/GS115進(jìn)行高密度發(fā)酵、純化,制備肽抗生素hPAB-β。采用稀釋法檢測了重組hPAB-β對Vero細(xì)胞的毒性,結(jié)果顯示高濃度的肽抗生素hPAB-β(1 mmol/L以上)對細(xì)胞有毒性,其對Vero細(xì)胞的最大無毒濃度為400μmol/L,約1.72mg/ml。以臨床標(biāo)本中分離的HSV-2為研究對象,將肽抗生素hPAB-β作用于HSV-21.5h后接種細(xì)胞,結(jié)果可見各實(shí)驗(yàn)稀釋度(400-10μmol/L)的肽抗生素都有抑制病毒噬斑形成的能力,隨著肽抗生素濃度的升高,噬斑形成數(shù)減少,表明經(jīng)酵母高密度發(fā)酵的肽抗生素hPAB-β對臨床分離的HSV-2有直接殺滅作用。病毒液對照(100TCID50的病毒液0.2ml+PBS 0.2m1)在培養(yǎng)20h時即開始出現(xiàn)細(xì)胞病變,培養(yǎng)2d后,對培養(yǎng)孔用1%結(jié)晶紫(含10%甲醛)染色,記數(shù)平均噬斑形成數(shù)目為101.7±5.5個。在同等實(shí)驗(yàn)條件下,阿昔洛韋的高濃度孔才能見其病毒抑制效應(yīng),在濃度降低至100μmol/L以下時,病毒噬斑形成數(shù)沒有明顯改變�；诖�,選用濃度為200μmol/L肽抗生素hPAB-β和阿昔洛韋的抗病毒活性進(jìn)行對比分析,以病毒對照組的噬斑形成率為100%,則肽抗生素hPAB-β作用組的噬斑形成率為48.7%；200μmol/L阿昔洛韋作用組的噬斑形成率為39.0%；與病毒對照組相比,兩個藥物作用組的病毒噬斑形成都有顯著降低(P值分別為0.02545和0.0103),肽抗生素作用組與阿昔洛韋藥物對照組相比,噬斑形成率略高(前者48.7%,后者39.0%),但兩者無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.06927)。表明肽抗生素hPAB-β對HSV-2具有良好的殺滅活性。 綜上所述,利用重組畢赤酵母高密度發(fā)酵,肽抗生素hPAB-β的表達(dá)量達(dá)到241.2±29.5 mg／L,經(jīng)10kDa膜過濾、反相層析、離子交換、分子篩層析等處理,從酵母發(fā)酵上清中純化得高純度目標(biāo)產(chǎn)物74.9±1.5 mg／L,總體純化效率為31.5%,該純化產(chǎn)物具有殺滅革蘭陰、陽性細(xì)菌的能力。采用PCR、病毒分離培養(yǎng)對60例疑似生殖器皰疹患者的標(biāo)本進(jìn)行檢測與鑒定研究,有45份PCR擴(kuò)增產(chǎn)物陽性,陽性率75%,均為HSV-2,而HSV-1型特異性引物的檢測為陰性；用Vero細(xì)胞進(jìn)行的病毒分離培養(yǎng),結(jié)果36例陽性,陽性率60%,和PCR檢測相比,差異非常顯著。利用病毒噬斑計數(shù)法對肽抗生素hPAB-β的抗病毒活性進(jìn)了分析,結(jié)果在200μmol/L hPAB-β或阿昔洛韋時的作用下,前者的病毒噬斑形成率為48.7%,后者為39.0%,與病毒對照組相比,兩者均顯著下降,而肽抗生素hPAB-β與阿昔洛韋組相比,對病毒噬斑形成的抑制無顯著差異(P=0.06927),表明經(jīng)酵母表達(dá)純化的肽抗生素hPAB-β具有抗HSV-2的活性,為深入分析其抗病毒機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：
均能很好表達(dá)目的條帶，表明所構(gòu)建的膚抗生素hRAB一p重組畢赤酵母pPIcgK~hPAB一p/GSI巧優(yōu)5菌株遺傳學(xué)穩(wěn)定。圖1-Figurel一l重組畢赤酵母ppICgK一h獄B一p/05115優(yōu)5菌株的篩選 ResereeningofreeombinantPPICgK一hPAB· p/GSI15strainyou一52、重組畢赤酵母高密度發(fā)酵將重組的優(yōu)5菌株接種于Zooml的BMGY培養(yǎng)基中，，30℃培養(yǎng)至作為種子菌，酵物約5ml，而后接種于發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵，檢測溶氧與pH，每隔測定OD值，并取lml懸液離心沉淀，上清留取電泳分析，OD6o。為6一88一12h取發(fā)稱出沉淀的
第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文重量，計算發(fā)酵過程中每升發(fā)酵液中菌體的濕重，并對時間作圖，得到如圖1一2所示的生長曲線(3次發(fā)酵的參數(shù))。從圖中可見，在種子接種后的16h內(nèi)，酵母菌生長迅速，加入補(bǔ)料后，酵母菌急速生長，在生長32h(菌體濕重達(dá)236.7土25.3留L)時停止流加補(bǔ)料，菌體生長速度下降，在誘導(dǎo)期間，菌體生長緩慢。在發(fā)酵過程中，間隔8一12h取樣進(jìn)行Tricine一SDS一PAGE電泳分析，結(jié)果見圖1一3。從圖中可見，在剛開始誘導(dǎo)時，上清中未見目標(biāo)膚分泌，加入誘導(dǎo)劑12h后
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R346
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本文編號：
2559650
