【摘要】： 目的: 胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)由于具備強(qiáng)大的自我更新及多向分化潛能等特性,可作為再生醫(yī)學(xué)中種子細(xì)胞的新來源,受到廣大學(xué)者的普遍關(guān)注。有關(guān)ESCs向腎細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究起步相對較晚,近年才見部分報道。體外研究表明,ESCs經(jīng)特定的細(xì)胞因子誘導(dǎo)可向一定類型的腎細(xì)胞分化;體內(nèi)研究表明,后腎細(xì)胞微環(huán)境在誘導(dǎo)ESCs向腎臟細(xì)胞分化過程中起重要作用。本研究通過體外共培養(yǎng)方式模擬后腎細(xì)胞微環(huán)境,探討其對ESCs向腎細(xì)胞方向分化的誘導(dǎo)作用,為研究ESCs向腎系細(xì)胞分化提供新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?并為探索后腎細(xì)胞微環(huán)境中影響ESCs向腎系細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法: 1.以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層傳代培養(yǎng)小鼠D3系ESCs,RT-PCR法鑒定多潛能標(biāo)志基因Oct4、Nanog和Sox2的表達(dá)。 2.通過懸滴法將ESCs制備成擬胚體(Embryoil Bodies,EBs),將EBs分為共培養(yǎng)組和自然分化組。共培養(yǎng)組:通過Transwells系統(tǒng)將EBs與孕12.5天的胎鼠后腎細(xì)胞進(jìn)行間接接觸共培養(yǎng);自然分化對照組:常規(guī)方法培養(yǎng)EBs,令其自然分化。 3.采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法觀察后腎細(xì)胞微環(huán)境對EBs表達(dá)腎小管細(xì)胞標(biāo)志物Pax2和腎足細(xì)胞標(biāo)志物WT1的影響。 4.采用RT-PCR方法觀察胚胎后腎細(xì)胞微環(huán)境對EBs表達(dá)腎臟發(fā)育相關(guān)基因(Pax2、WT1、GDNF、Emx2、BMP-7、Nephrin和KSP)及腎祖細(xì)胞標(biāo)志CD24基因的影響。 結(jié)果: 1.ESCs在飼養(yǎng)層細(xì)胞上呈集落樣生長,RT-PCR結(jié)果顯示其多潛能標(biāo)志基因Oct4、Sox2、Nanog強(qiáng)表達(dá),說明用于本實(shí)驗(yàn)的ESCs處于未分化狀態(tài)。 2.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示,共培養(yǎng)組EBs第3天即可見Pax2陽性細(xì)胞,且隨著共培養(yǎng)時間延長, Pax2陽性細(xì)胞逐漸增多,且可見部分陽性細(xì)胞成簇排列,形態(tài)類似圓環(huán)狀,而自然分化組EBs于第7天見少數(shù)Pax2陽性細(xì)胞,經(jīng)統(tǒng)計分析,共培養(yǎng)組Pax2陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于自然分化組(P0.05);共培養(yǎng)組EBs第3天即可見WT1陽性細(xì)胞,且隨著共培養(yǎng)時間延長,WT1陽性細(xì)胞逐漸增多,而自然分化組EBs未見WT1陽性細(xì)胞。表明間接接觸共培養(yǎng)方式模擬的胚胎后腎細(xì)胞微環(huán)境可促進(jìn)ESCs向腎小管細(xì)胞和腎足細(xì)胞分化。 3.RT-PCR結(jié)果顯示,與自然分化組比較,共培養(yǎng)早期,后腎細(xì)胞微環(huán)境可促進(jìn)后腎發(fā)育早期基因(Pax2、WT1)、后腎發(fā)育中期基因(Emx2、GDNF、BMP7)及腎祖細(xì)胞標(biāo)志CD24基因的表達(dá),隨著共培養(yǎng)時間的延長,后腎發(fā)育晚期基因(Nephrin、KSP)的表達(dá)增強(qiáng),而后腎發(fā)育早期基因(Pax2、WT1)及后腎發(fā)育中期基因(Emx2、GDNF、BMP7)的表達(dá)減弱。提示間接接觸共培養(yǎng)方式模擬的胚胎后腎細(xì)胞微環(huán)境可調(diào)控ESCs表達(dá)后腎發(fā)育相關(guān)基因。 結(jié)論: 間接接觸共培養(yǎng)方式模擬的胚胎后腎細(xì)胞微環(huán)境可誘導(dǎo)ESCs向腎系細(xì)胞分化,并可調(diào)控后腎發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。
【圖文】：

圖 2-1 各組細(xì)胞培養(yǎng)模型2.2.5.2 細(xì)胞免疫熒光染色分析 Pax2、WT1 蛋白的表達(dá)細(xì)胞免疫熒光染色法檢測不同時間點(diǎn) EBs 細(xì)胞中后腎發(fā)育相關(guān)蛋白 Pax2、WT1 的表達(dá)。主要步驟包括：分別在后腎細(xì)胞誘導(dǎo)第 3、5、7 天，輕輕吸除 12孔板中培養(yǎng)液，PBS 清洗 EBs 細(xì)胞一遍后，以 4%多聚甲醛/PBS 室溫固定 15分鐘，PBS 洗 3 遍，1% Triton X-100/PBS 于室溫 15 分鐘透膜；用 10% BSA/PBS室溫封閉 30 分鐘。去除 BSA，加入 1：100 PBS 稀釋的一抗，，4℃ 濕盒內(nèi)過夜。次日，PBS 3×5 分鐘洗去一抗，加入 1：100 PBS 稀釋羅丹明標(biāo)記的熒光二抗，37℃孵箱內(nèi)反應(yīng) 1 小時，PBS 3×5 分鐘洗去二抗，以 0.5μg/ml DAPI 處理 15 分鐘標(biāo)記細(xì)胞核，PBS 洗后用甘油緩沖劑封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果判定：胞核呈紅色熒光的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。陽性細(xì)胞計數(shù)：隨機(jī)選取 10 個 200 倍視野進(jìn)行觀察計數(shù)，分別計算陽性細(xì)

小鼠胚胎干細(xì)胞D3系細(xì)胞形態(tài)（bar=50μm）及多潛能狀態(tài)鑒定
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉愛軍,黃錦桃,朱永紅,李海標(biāo);胚胎干細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞在腎被囊微環(huán)境中分化潛能的研究[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2005年03期

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本文編號：2559827