發(fā)布時(shí)間：2019-11-11 13:30

【摘要】：目的 構(gòu)建2型單純皰疹病毒載體疫苗，檢測重組載體疫苗的免疫效果，為獲得預(yù)防和治療2型單純皰疹病毒慢性感染的重組載體疫苗奠定理論基礎(chǔ)，為2型單純皰疹病毒疫苗的研制提供一種新的策略。完善恥垢分枝桿菌載體疫苗構(gòu)建技術(shù)，為其作為病毒疫苗制備平臺(tái)提供技術(shù)支持。 方法 1、pmv261-gBD-570質(zhì)粒的構(gòu)建 查閱文獻(xiàn)，根據(jù)GeneBank中登記的HSV-2gD和gB的基因序列構(gòu)建gBD-570，將含有EcorI和salI酶切位點(diǎn)的gBD-570亞克隆入載體puc57，經(jīng)鑒定正確后，，同時(shí)酶切穿梭質(zhì)粒PMV-261和puc57-gBD-570，并將酶切片段gBD-570回收后亞克隆入酶切后的穿梭質(zhì)粒PMV-261中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pmv-gBD-570，經(jīng)提質(zhì)粒，酶切和菌落PCR鑒定正確后提取重組質(zhì)粒，-20℃保存?zhèn)溆谩?2、目的基因gBD-570的蛋白表達(dá) 將提取的質(zhì)粒通過電穿孔亞克隆入恥垢分枝桿菌（MC2155），用SDS-PAGE方法鑒定gBD-570的表達(dá)。 3.免疫動(dòng)物 6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組（每組10只），于小鼠雙側(cè)股四頭肌注射免疫，各組依次為：1組，每側(cè)各注射NS（生理鹽水）200μl；2組，每側(cè)各注射空載體質(zhì)粒PMV261200μl（1mg/ml）；3組，每側(cè)各注射1×106cfu/ml的MC2155200μl（1mg/ml）；4組，注射低濃度（1×104cfu/ml）的重組MC2155200μl；5組，注射中濃度（1×106cfu/ml）組的重組MC2155200μl；6組，高濃度（1×108cfu/ml）組的重組MC2155200μl。免疫完成三周后，于小鼠斷尾采血，間接ELISA法檢測血清IgG、IFN-γ及IL-2表達(dá)量，并通過MTT法對(duì)小鼠的脾淋巴細(xì)胞增值率進(jìn)行檢測 結(jié)果 1、構(gòu)建重組質(zhì)粒PMV-gBD-570轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR、雙酶切以及測序鑒定正確，質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2、將構(gòu)建成功的質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化入恥垢分枝桿菌MS中，經(jīng)菌落PCR及雙酶切鑒定正確，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。 3、SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒可以在MS中正確表達(dá) 4、免疫小鼠后實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：中濃度組重組MC2155和高濃度組MC2155的免疫效果均優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組，能夠較好的誘導(dǎo)體液免疫及細(xì)胞免疫。 結(jié)論 1、成功構(gòu)建了融合蛋白表達(dá)載體PMV261-gBD-570 2、重組表達(dá)載體在恥垢分枝桿菌中獲得了有效表達(dá) 3、重組恥垢分支桿菌能夠較好的誘導(dǎo)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫，為下一步的疫苗制備工作奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：泰山醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 孫妍;HSV-2及其所致生殖道皰疹[J];國外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊(cè);2002年04期

2 姚敏;吳李梅;沈云良;謝碧波;;2009年浙江省國家級(jí)性病監(jiān)測點(diǎn)性病流行病學(xué)分析[J];疾病監(jiān)測;2010年09期

3 樊建勇;楊慧蘭;關(guān)蕾;王穎;仕瑤慧;;熱休克蛋白70-Ⅱ型單純皰疹病毒糖蛋白DDNA疫苗的構(gòu)建及表達(dá)[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2007年04期

4 李偉榮;王得新;楊琪;牛勃;王佳偉;馮子敬;;IL-2與HSV-1糖蛋白D共表達(dá)核酸疫苗的免疫效果研究[J];中國臨床神經(jīng)科學(xué);2006年02期

5 周文泉,桑紅;生殖器皰疹的流行病學(xué)和診治進(jìn)展[J];中華男科學(xué);2003年08期

6 蔡恒玲;劉應(yīng)輝;劉娜娜;;雌孕激素在構(gòu)建小鼠生殖器皰疹動(dòng)物模型中的比較研究[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2012年02期

7 王麗梅;師長宏;柏銀蘭;張海;康健;張薇;徐志凱;;結(jié)核桿菌Hsp65與人IL-2融合蛋白在恥垢桿菌表達(dá)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年18期

8 張華捷;張庶民;;Ⅱ型單純皰疹病毒疫苗的研究進(jìn)展[J];中國生物制品學(xué)雜志;2010年06期

9 袁正宏,方昕,鄭玲潔,姚忻,何麗芳,聞?dòng)衩?免疫途徑及載體對(duì)乙肝病毒DNA疫苗免疫效果影響的研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1999年01期

本文編號(hào)：2559282