發(fā)布時間：2019-11-11 11:21

【摘要】： 冠心病(coronary heart disease,CHD)是最常見的心腦血管疾病之一,其發(fā)病率逐漸增高,1998年至2008年間,我國男性冠心病發(fā)病率較以往同期約增加26%,女性約增加19%,其死亡率也呈迅速上升趨勢,是我國居民死因構成中上升最快的疾病,已成為威脅我國公眾健康的重要疾病,如何有效防治是醫(yī)療行業(yè)和社會關注的重點。但是CHD的發(fā)病機制至今仍不完全明了,成為阻礙其治療進展的主要難題。動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是CHD的主要病理基礎。以往關于AS形成的機制主要圍繞三種學說:脂質沉淀學說、損傷修復學說和血栓形成學說。高血壓、吸煙、血脂異常、糖尿病、超重和肥胖、年齡、性別、高半胱氨酸血癥以及高尿酸血癥等導致血管內皮損傷和脂質沉積的內在因素,被認為是CHD發(fā)病的高危因素。遠離這些危險因素,或者控制這些因素的惡化,均可在一定程度上取得預防AS發(fā)生發(fā)展的效果。近年來,隨著急性冠脈綜合癥(acute coronary syndrome,ACS)這個CHD的急性進展階段的界定,使得人們重新認識了CHD發(fā)展階段的病理和病理生理特點。ACS的病理基礎是易損斑塊,研究發(fā)現(xiàn)易損斑塊伴隨著大量炎癥細胞和免疫細胞的介入,是斑塊不穩(wěn)定和容易破裂的主要原因;ACS患者存在全身炎癥因子和炎癥反應活化的情況。進一步研究發(fā)現(xiàn)AS的所有階段都有免疫細胞的介入,于是提出CHD是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病這一新觀點,認為內在或外在危險因素導致的炎癥和免疫反應是AS發(fā)病的基礎。 自1973年Steinman和Cohn發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)以來,大量研究證明,DCs是免疫過程中起負責抗原呈遞的細胞,是機體內功能最強的專職抗原呈遞細胞(antigen presenting cell,APC)。極少量的DCs即可強烈激活T淋巴細胞啟動特異性細胞免疫反應,在免疫應答的誘導和調節(jié)中起重要作用。最近研究證實DCs在AS病變中聚集明顯增加,與T淋巴細胞共同出現(xiàn)在AS的病變薄弱部位,使得人們推測DCs在AS的發(fā)生發(fā)展中可能同樣起著啟動炎癥和免疫反應的作用,而采取他汀類藥物干預AS患者的DCs可以抑制其免疫活性,可能在AS的免疫調節(jié)治療中起作用。 進一步研究需要在AS模型中觀察DCs的作用。鼠、兔的動脈粥樣硬化模型是目前廣泛應用于AS研究的動物模型之一,DCs的研究其細胞來源主要是人外周血、骨髓、臍血或者是鼠骨髓源的單核細胞。Virginia采取人粒-巨噬細胞集落刺激因子(human granulocyte macrophage colony stimulating factor,hGM-CSF)與人白細胞介素-4(human interleukin-4,hIL-4)刺激培養(yǎng)兔骨髓源性樹突狀細胞成功則提供了DCs細胞培養(yǎng)的新的選擇。 血脂的改變在AS的形成中起著非常重要的作用。高密度脂蛋白(highdensitv lipoprotein,HDL)具有抗動脈粥樣硬化的作用,低HDL水平是冠心病發(fā)病的危險因素之一。目前認為HDL抗動脈粥樣硬化的作用主要是由其逆轉運膽固醇的功能密切相關,HDL逆轉運膽固醇由其載脂蛋白A-I(apolipoproteinA-I,apoA-I)結合到細胞膜上的ATP結合盒轉運體Al(ATP-binding cassettetransporter A1,ABCAl)介導。最近的研究發(fā)現(xiàn)HDL在體內可以被內皮細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞氧化修飾,HDL被氧化修飾后發(fā)生結構改變,導致結合和通過ABCAl轉運膽固醇的能力下降,而且具有細胞毒性作用,從而促進AS發(fā)生。 趨化因子是能使細胞發(fā)生趨化運動的小分子細胞因子,趨化因子結構和功能相似,分子量多在8-12KD之間,對嗜中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞等多種細胞均有趨化作用。近年來,趨化因子及其受體的研究越來越受到重視,已經證明它們在機體發(fā)揮重要的生理和病理效應,在炎癥、腫瘤、自身免疫病、變態(tài)反應、AIDS等疾病中均有趨化因子及其受體的參與,重組趨化因子、趨化因子及其抗體的拮抗劑已經進入臨床研究,成為新的生物治療熱點。 DCs作為目前已知功能最強的專職抗原呈遞細胞,是否能吞噬和捕獲ox-HDL并向T細胞提呈抗原,以及ox-HDL對Des的成熟及其趨化因子單核細胞趨化蛋白-l(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)與巨噬細胞炎性蛋白-1a(macrophage inflammatory protein-1a,MIP-1a)分泌的影響,目前研究尚不明了。 本課題分為兩個部分,第一部分研究在hGM-CSF+hIL-4作用下體外培養(yǎng)。誘導兔外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)以及骨髓單個核細胞(bone marrow monouclear cells,BMMC)轉化為Des的方法,并采取LPS誘導DCs的成熟,旨在為AS的組織工程和臨床細胞診斷、治療的研究奠定基礎。第二部分利用熒光染料DiI標記ox-HDL,在體外觀察Des對其的捕獲過程及ox-HDL誘導Des成熟情況,探討ox-HDL對Des成熟的影響,并利用ELISA方法,在體外觀察ox-HDL對DCs趨化因子MIP-1a和MCP-1分泌,為進一步研究ox-HDL抗原呈遞機制及動脈粥樣硬化形成機制研究奠定基礎。其結果分述如下: 1兔PBMC源性及BMMC源性DCs體外培養(yǎng)的研究 通過密度梯度離心的方法收集到的單只兔外周血20mL轉化為DCs的數(shù)量約為10-20×10~6,單只兔骨髓液10mL轉化為DCs的數(shù)量約為5-10×10~6。 1.1細胞的形態(tài)學結果 培養(yǎng)第2天對照組細胞粘附于聚苯乙烯培養(yǎng)瓶底部,DC組的細胞部分在培養(yǎng)基中懸浮生長,細胞較小,形念無明顯差別。培養(yǎng)第6天對照組的細胞呈圓形或橢圓形,粘附于培養(yǎng)瓶瓶底,掃描電鏡下細胞呈圓形及橢圓形,表面有小桿狀突起;DC組的細胞懸浮生長,可見部分細胞聚集成簇,細胞表面可見數(shù)量不等、形態(tài)不一的樹突樣突起,掃描電鏡下細胞呈不規(guī)則形,表面粗糙,胞體有形態(tài)不一的突起。 1.2細胞的流式細胞學表型分析結果 培養(yǎng)6天后外周血源性DC組與骨髓源性DC組的細胞MHCⅡ、CD86高表達,CDl4低表達。相同來源的不同細胞各組間行獨立樣本t檢驗:外周血源性DC組與外周血源性對照組的MHCⅡ、CD86、CDl4比較差異有顯著性意義(p＜0.001),骨髓源性DC組與骨髓源性對照組MHCⅡ、CD86、CDl4比較差異有顯著性意義(p＜0.001)。不同來源的同類細胞行各組間行獨立樣本t檢驗:外周血源性DC組與骨髓源性DC組的MHCⅡ、CD86、CDl4比較差異無顯著性意義(p＞0.05),外周血源性對照組與骨髓源性對照組的MHCⅡ、CD86、CDl4比較差異無顯著性意義(p＞0.05)。析因設計資料的方差分析提示不同標本來源的細胞問比較差異無顯著性意義(p＞0.05),不同刺激方法培養(yǎng)的細胞間比較差異有顯著性意義(p＜0.001)。 1.3吞噬功能檢測 成熟DCs的吞噬功能下降,主要表現(xiàn)為抗原呈遞功能,為此用流式的方法比較巨噬細胞和成熟DCs在37℃條件下對FITC—dextran的攝取能力的差異。析因設計資料的方差分析提示不同標本來源的細胞間比較差異無顯著性意義(p＞0.05),不同刺激方法培養(yǎng)的細胞間比較差異有顯著性意義(p＜0.001)。兩組間獨立樣本t檢驗結果顯示,外周血源性DCs組和骨髓源性DCs組細胞吞噬能力表達較低,兩種來源的對照組細胞吞噬能力表達較強。外周血源性DC組與骨髓源性DC組之間、外周血源性對照組與骨髓源性對照組之間比較差異無顯著性意義(p＞0.05),外周血源性DC組與外周血源性對照組之間、骨髓源性DC組與骨髓源性對照組之間比較差異有顯著性意義(p＜0.001)。 2 ox-HDL對兔PBMC源性DCs的成熟及趨化因子分泌的影響 2.1 DCs的培養(yǎng)和觀察 倒置相差顯微鏡下:培養(yǎng)第2天各組細胞部分在培養(yǎng)基中懸浮生長,細胞較小,圓形。培養(yǎng)第5天細胞懸浮生長,可見部分細胞聚集成簇,細胞形態(tài)不規(guī)則,表面可見數(shù)量不等、形態(tài)不一的樹突樣突起,細胞質變得豐富。加入50μg/mLHDL、ox-HDL后,細胞形態(tài)無明顯改變,細胞大部分懸浮或半貼壁,少數(shù)貼壁。 2.2 DCs對DiI標記的ox-HDL的加工處理和抗原呈遞 DCs與DiI標記的ox-HDL混合孵育2小時,熒光顯微鏡觀察顯示原本無色的DCs,在攝取了經DiI標記的ox-HDL后,胞漿也變的紅染,培養(yǎng)2天后,這種情況則顯示更為明顯。DiI良好顯示DCs攝取ox-HDL抗原和成熟過程。DCs開始為較小的幼稚多形細胞,其攝取抗原過程清晰可見,在攝取抗原后逐漸發(fā)育變大,胞漿逐漸豐富,變?yōu)椴灰?guī)則多型狀態(tài),并有較多偽足伸出。 2.3 ox-HDL對DCs表型的影響 收集干預48h的懸浮細胞,經FACS分析顯示,與陰性對照PBS組相比,經HDL及ox-HDL處理的DCs其表面分子CD86和MHCⅡ的表達均上調,CDl4的表達均下調。行One-Way ANOVA檢驗,MHCⅡ、CD86、CDl4(CDl4方差不齊,采用Welch法校正)在各組間差異有顯著性意義(p＜0.001)。Dunnett'sT3多重比較提示HDL組與PBS組的MHCⅡ、CD86、CDl4比較差異無顯著性意義(p＞0.05),ox-HDL組與PBS組之間(p＜0.001)、ox-HDL組與HDL組之間(P＜0.01)的MHCⅡ、CD86、CDl4比較差異均有顯著性意義。 2.4與ox-HDL共同培養(yǎng)的DCs上清液趨化因子MIP-1a和MCP-1檢測結果: 上清液趨化因子MIP-1a的ELISA檢測結果進行析因設計資料的方差分析提示:時間因素對上清液的MIP-1a表達量的影響有顯著性意義(F=34.520,p＜0.001),分組因素(培養(yǎng)環(huán)境中的干預因素)對上清液的MIP-1a表達量的影響無顯著性意義(F=0.722,P＞0.05)。繼續(xù)行One-Way ANOVA檢驗顯示不同時間段的MIP-1a表達量不同,多重比較顯示除HDL組在24小時與48小時之間差異無顯著性意義外(P=0.102),其余各時間段之間的兩兩比較,其MIP-1a表達量差異均有顯著性意義(p＜0.05),但是不同分組,即按不同干預條件對各時間段的上清液MIP-1a表達量影響均無顯著性意義(p＞0.05)。 上清液趨化因子MCP-1的ELISA檢測結果進行析因設計資料的方差分析提示:時間因素對上清液的MCP-1表達量的影響有顯著性意義(F=31.481,P＜0.001),分組因素對上清液的MIP-1a表達量的影響有顯著性意義(F=47.931,p＜0.001)。繼續(xù)行One-Way ANOVA及Dunnett's T3多重比較提示:不同時間段的MCP-1表達量不同,除PBS組在12小時與24小時之間差異無顯著性意義外(p=0.383),其余各時間段之間的兩兩比較,MCP-1表達量差異均有顯著性意義(p＜0.001)。不同分組,即不同干預條件對各時間段的上清液MCP-1表達量影響差異有顯著性意義(p＜0.001),多重比較顯示ox-HDL的影響與其他因素單獨比較,在各時間段的差異均有顯著性意義(P＜0.05)。 通過上述兩個章節(jié)實驗,我們總結以下結論和創(chuàng)新: (1)兔PBMC及BMMC均能在hGM-CSF+hlL-4的作用下經過5天的培養(yǎng)被誘導分化為DCs,但PBMC源性的DCs表型表達的陽性率高于BMMC源性的DCs。經過LPS的作用,兩種來源的DCs均能轉化為成熟樹突狀細胞; (2)體外培養(yǎng)的兔PBMC源性DCs經過ox-HDL的干預,其CD86、MHCⅡ表達上調,CDl4表達下調,符合成熟DCs的特征。 (3)通過DiI熒光染料從形態(tài)學上對DCs攝取ox-HDL的過程顯示DCs攝取ox-HDL和成熟過程,進一步證實ox-HDL可以被DCs識別,并通過受體攝取、內吞入胞漿中。 (4)兔DCs經過ox-HDL的干預,可以增加DCs分泌MCP-1。 (5)ox-HDL對DCs趨化因子的影響使得DCs遷徙變化,可能參與動脈粥樣硬化的形成。
【圖文】：

源性DC組之間、外周血源性對照組與骨髓源性對照組之間比較差異無顯著性意義(尸)a05)，外周血源性DC組與外周血源性對照組之間、骨髓源性DC組與骨髓源性對照組之間比較差異有顯著性意義(尸燈 a001)。(表1一3，圖1一5，1一6)表l一 3Dextron吞噬實驗流式分析結果(%，丁土·)Tab.l一 3PhenotyPeanalysisofuPtakeofdextranPBMC(n=12)BMMC(n=12)Sum(n=24)之產，，PDC(n=12)27.33士 9.1123.60士 11.5425.47士 10.341.1反歹(t)0.245對照(n二12)72.57士 15.2275.72士 15.4774.14士 15.230.376(t夕漢710Sum(n二24)49.95士 26.16049.66士 29.8549.81士 27.760.00擴廠刀 0.94口之布一189‘t)一Z只灸歹‘t)163.匆夕‘萬夕尸，欲818 P0.0000.O0O0.OOJP八二0

2.2.2DCs對DII標記的OxHDL的加工處理和抗原呈遞DCS與DII標記的ox一HDL混合孵育2小時，熒光顯微鏡觀察顯示原本無色的DCs，在攝取了經DII標一記的ox一HDL后，胞漿也變的紅染(圖2一IA)，培養(yǎng)2天后，這種情況則顯示更為明顯(圖2一IB)。1)11良好顯示DCs攝取ox一HDL抗原和成熟過程。DCS開始為較小的幼稚多形細胞，其攝取抗原過程清晰可見，在攝取抗原后逐漸發(fā)育變大，胞漿逐漸豐富，變?yōu)椴灰?guī)則多型狀態(tài)，并有較多偽足伸出。圖2一 1DCS對DII標記的ox一HDL的攝取(K200) F19.2一 1DII一ox一 HDLuPtakenbyDCs(X200)
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2559236