【摘要】： 冠心病(coronary heart disease,CHD)是最常見的心腦血管疾病之一,其發(fā)病率逐漸增高,1998年至2008年間,我國(guó)男性冠心病發(fā)病率較以往同期約增加26%,女性約增加19%,其死亡率也呈迅速上升趨勢(shì),是我國(guó)居民死因構(gòu)成中上升最快的疾病,已成為威脅我國(guó)公眾健康的重要疾病,如何有效防治是醫(yī)療行業(yè)和社會(huì)關(guān)注的重點(diǎn)。但是CHD的發(fā)病機(jī)制至今仍不完全明了,成為阻礙其治療進(jìn)展的主要難題。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是CHD的主要病理基礎(chǔ)。以往關(guān)于AS形成的機(jī)制主要圍繞三種學(xué)說:脂質(zhì)沉淀學(xué)說、損傷修復(fù)學(xué)說和血栓形成學(xué)說。高血壓、吸煙、血脂異常、糖尿病、超重和肥胖、年齡、性別、高半胱氨酸血癥以及高尿酸血癥等導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷和脂質(zhì)沉積的內(nèi)在因素,被認(rèn)為是CHD發(fā)病的高危因素。遠(yuǎn)離這些危險(xiǎn)因素,或者控制這些因素的惡化,均可在一定程度上取得預(yù)防AS發(fā)生發(fā)展的效果。近年來,隨著急性冠脈綜合癥(acute coronary syndrome,ACS)這個(gè)CHD的急性進(jìn)展階段的界定,使得人們重新認(rèn)識(shí)了CHD發(fā)展階段的病理和病理生理特點(diǎn)。ACS的病理基礎(chǔ)是易損斑塊,研究發(fā)現(xiàn)易損斑塊伴隨著大量炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞的介入,是斑塊不穩(wěn)定和容易破裂的主要原因;ACS患者存在全身炎癥因子和炎癥反應(yīng)活化的情況。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AS的所有階段都有免疫細(xì)胞的介入,于是提出CHD是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病這一新觀點(diǎn),認(rèn)為內(nèi)在或外在危險(xiǎn)因素導(dǎo)致的炎癥和免疫反應(yīng)是AS發(fā)病的基礎(chǔ)。 自1973年Steinman和Cohn發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)以來,大量研究證明,DCs是免疫過程中起負(fù)責(zé)抗原呈遞的細(xì)胞,是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)。極少量的DCs即可強(qiáng)烈激活T淋巴細(xì)胞啟動(dòng)特異性細(xì)胞免疫反應(yīng),在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)中起重要作用。最近研究證實(shí)DCs在AS病變中聚集明顯增加,與T淋巴細(xì)胞共同出現(xiàn)在AS的病變薄弱部位,使得人們推測(cè)DCs在AS的發(fā)生發(fā)展中可能同樣起著啟動(dòng)炎癥和免疫反應(yīng)的作用,而采取他汀類藥物干預(yù)AS患者的DCs可以抑制其免疫活性,可能在AS的免疫調(diào)節(jié)治療中起作用。 進(jìn)一步研究需要在AS模型中觀察DCs的作用。鼠、兔的動(dòng)脈粥樣硬化模型是目前廣泛應(yīng)用于AS研究的動(dòng)物模型之一,DCs的研究其細(xì)胞來源主要是人外周血、骨髓、臍血或者是鼠骨髓源的單核細(xì)胞。Virginia采取人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(human granulocyte macrophage colony stimulating factor,hGM-CSF)與人白細(xì)胞介素-4(human interleukin-4,hIL-4)刺激培養(yǎng)兔骨髓源性樹突狀細(xì)胞成功則提供了DCs細(xì)胞培養(yǎng)的新的選擇。 血脂的改變?cè)贏S的形成中起著非常重要的作用。高密度脂蛋白(highdensitv lipoprotein,HDL)具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用,低HDL水平是冠心病發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。目前認(rèn)為HDL抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用主要是由其逆轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的功能密切相關(guān),HDL逆轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇由其載脂蛋白A-I(apolipoproteinA-I,apoA-I)結(jié)合到細(xì)胞膜上的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al(ATP-binding cassettetransporter A1,ABCAl)介導(dǎo)。最近的研究發(fā)現(xiàn)HDL在體內(nèi)可以被內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞氧化修飾,HDL被氧化修飾后發(fā)生結(jié)構(gòu)改變,導(dǎo)致結(jié)合和通過ABCAl轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的能力下降,而且具有細(xì)胞毒性作用,從而促進(jìn)AS發(fā)生。 趨化因子是能使細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的小分子細(xì)胞因子,趨化因子結(jié)構(gòu)和功能相似,分子量多在8-12KD之間,對(duì)嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等多種細(xì)胞均有趨化作用。近年來,趨化因子及其受體的研究越來越受到重視,已經(jīng)證明它們?cè)跈C(jī)體發(fā)揮重要的生理和病理效應(yīng),在炎癥、腫瘤、自身免疫病、變態(tài)反應(yīng)、AIDS等疾病中均有趨化因子及其受體的參與,重組趨化因子、趨化因子及其抗體的拮抗劑已經(jīng)進(jìn)入臨床研究,成為新的生物治療熱點(diǎn)。 DCs作為目前已知功能最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞,是否能吞噬和捕獲ox-HDL并向T細(xì)胞提呈抗原,以及ox-HDL對(duì)Des的成熟及其趨化因子單核細(xì)胞趨化蛋白-l(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)與巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1a(macrophage inflammatory protein-1a,MIP-1a)分泌的影響,目前研究尚不明了。 本課題分為兩個(gè)部分,第一部分研究在hGM-CSF+hIL-4作用下體外培養(yǎng)。誘導(dǎo)兔外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)以及骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow monouclear cells,BMMC)轉(zhuǎn)化為Des的方法,并采取LPS誘導(dǎo)DCs的成熟,旨在為AS的組織工程和臨床細(xì)胞診斷、治療的研究奠定基礎(chǔ)。第二部分利用熒光染料DiI標(biāo)記ox-HDL,在體外觀察Des對(duì)其的捕獲過程及ox-HDL誘導(dǎo)Des成熟情況,探討ox-HDL對(duì)Des成熟的影響,并利用ELISA方法,在體外觀察ox-HDL對(duì)DCs趨化因子MIP-1a和MCP-1分泌,為進(jìn)一步研究ox-HDL抗原呈遞機(jī)制及動(dòng)脈粥樣硬化形成機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。其結(jié)果分述如下: 1兔PBMC源性及BMMC源性DCs體外培養(yǎng)的研究 通過密度梯度離心的方法收集到的單只兔外周血20mL轉(zhuǎn)化為DCs的數(shù)量約為10-20×10~6,單只兔骨髓液10mL轉(zhuǎn)化為DCs的數(shù)量約為5-10×10~6。 1.1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)結(jié)果 培養(yǎng)第2天對(duì)照組細(xì)胞粘附于聚苯乙烯培養(yǎng)瓶底部,DC組的細(xì)胞部分在培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng),細(xì)胞較小,形念無(wú)明顯差別。培養(yǎng)第6天對(duì)照組的細(xì)胞呈圓形或橢圓形,粘附于培養(yǎng)瓶瓶底,掃描電鏡下細(xì)胞呈圓形及橢圓形,表面有小桿狀突起;DC組的細(xì)胞懸浮生長(zhǎng),可見部分細(xì)胞聚集成簇,細(xì)胞表面可見數(shù)量不等、形態(tài)不一的樹突樣突起,掃描電鏡下細(xì)胞呈不規(guī)則形,表面粗糙,胞體有形態(tài)不一的突起。 1.2細(xì)胞的流式細(xì)胞學(xué)表型分析結(jié)果 培養(yǎng)6天后外周血源性DC組與骨髓源性DC組的細(xì)胞MHCⅡ、CD86高表達(dá),CDl4低表達(dá)。相同來源的不同細(xì)胞各組間行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn):外周血源性DC組與外周血源性對(duì)照組的MHCⅡ、CD86、CDl4比較差異有顯著性意義(p＜0.001),骨髓源性DC組與骨髓源性對(duì)照組MHCⅡ、CD86、CDl4比較差異有顯著性意義(p＜0.001)。不同來源的同類細(xì)胞行各組間行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn):外周血源性DC組與骨髓源性DC組的MHCⅡ、CD86、CDl4比較差異無(wú)顯著性意義(p＞0.05),外周血源性對(duì)照組與骨髓源性對(duì)照組的MHCⅡ、CD86、CDl4比較差異無(wú)顯著性意義(p＞0.05)。析因設(shè)計(jì)資料的方差分析提示不同標(biāo)本來源的細(xì)胞問比較差異無(wú)顯著性意義(p＞0.05),不同刺激方法培養(yǎng)的細(xì)胞間比較差異有顯著性意義(p＜0.001)。 1.3吞噬功能檢測(cè) 成熟DCs的吞噬功能下降,主要表現(xiàn)為抗原呈遞功能,為此用流式的方法比較巨噬細(xì)胞和成熟DCs在37℃條件下對(duì)FITC—dextran的攝取能力的差異。析因設(shè)計(jì)資料的方差分析提示不同標(biāo)本來源的細(xì)胞間比較差異無(wú)顯著性意義(p＞0.05),不同刺激方法培養(yǎng)的細(xì)胞間比較差異有顯著性意義(p＜0.001)。兩組間獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,外周血源性DCs組和骨髓源性DCs組細(xì)胞吞噬能力表達(dá)較低,兩種來源的對(duì)照組細(xì)胞吞噬能力表達(dá)較強(qiáng)。外周血源性DC組與骨髓源性DC組之間、外周血源性對(duì)照組與骨髓源性對(duì)照組之間比較差異無(wú)顯著性意義(p＞0.05),外周血源性DC組與外周血源性對(duì)照組之間、骨髓源性DC組與骨髓源性對(duì)照組之間比較差異有顯著性意義(p＜0.001)。 2 ox-HDL對(duì)兔PBMC源性DCs的成熟及趨化因子分泌的影響 2.1 DCs的培養(yǎng)和觀察 倒置相差顯微鏡下:培養(yǎng)第2天各組細(xì)胞部分在培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng),細(xì)胞較小,圓形。培養(yǎng)第5天細(xì)胞懸浮生長(zhǎng),可見部分細(xì)胞聚集成簇,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,表面可見數(shù)量不等、形態(tài)不一的樹突樣突起,細(xì)胞質(zhì)變得豐富。加入50μg/mLHDL、ox-HDL后,細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變,細(xì)胞大部分懸浮或半貼壁,少數(shù)貼壁。 2.2 DCs對(duì)DiI標(biāo)記的ox-HDL的加工處理和抗原呈遞 DCs與DiI標(biāo)記的ox-HDL混合孵育2小時(shí),熒光顯微鏡觀察顯示原本無(wú)色的DCs,在攝取了經(jīng)DiI標(biāo)記的ox-HDL后,胞漿也變的紅染,培養(yǎng)2天后,這種情況則顯示更為明顯。DiI良好顯示DCs攝取ox-HDL抗原和成熟過程。DCs開始為較小的幼稚多形細(xì)胞,其攝取抗原過程清晰可見,在攝取抗原后逐漸發(fā)育變大,胞漿逐漸豐富,變?yōu)椴灰?guī)則多型狀態(tài),并有較多偽足伸出。 2.3 ox-HDL對(duì)DCs表型的影響 收集干預(yù)48h的懸浮細(xì)胞,經(jīng)FACS分析顯示,與陰性對(duì)照PBS組相比,經(jīng)HDL及ox-HDL處理的DCs其表面分子CD86和MHCⅡ的表達(dá)均上調(diào),CDl4的表達(dá)均下調(diào)。行One-Way ANOVA檢驗(yàn),MHCⅡ、CD86、CDl4(CDl4方差不齊,采用Welch法校正)在各組間差異有顯著性意義(p＜0.001)。Dunnett'sT3多重比較提示HDL組與PBS組的MHCⅡ、CD86、CDl4比較差異無(wú)顯著性意義(p＞0.05),ox-HDL組與PBS組之間(p＜0.001)、ox-HDL組與HDL組之間(P＜0.01)的MHCⅡ、CD86、CDl4比較差異均有顯著性意義。 2.4與ox-HDL共同培養(yǎng)的DCs上清液趨化因子MIP-1a和MCP-1檢測(cè)結(jié)果: 上清液趨化因子MIP-1a的ELISA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行析因設(shè)計(jì)資料的方差分析提示:時(shí)間因素對(duì)上清液的MIP-1a表達(dá)量的影響有顯著性意義(F=34.520,p＜0.001),分組因素(培養(yǎng)環(huán)境中的干預(yù)因素)對(duì)上清液的MIP-1a表達(dá)量的影響無(wú)顯著性意義(F=0.722,P＞0.05)。繼續(xù)行One-Way ANOVA檢驗(yàn)顯示不同時(shí)間段的MIP-1a表達(dá)量不同,多重比較顯示除HDL組在24小時(shí)與48小時(shí)之間差異無(wú)顯著性意義外(P=0.102),其余各時(shí)間段之間的兩兩比較,其MIP-1a表達(dá)量差異均有顯著性意義(p＜0.05),但是不同分組,即按不同干預(yù)條件對(duì)各時(shí)間段的上清液MIP-1a表達(dá)量影響均無(wú)顯著性意義(p＞0.05)。 上清液趨化因子MCP-1的ELISA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行析因設(shè)計(jì)資料的方差分析提示:時(shí)間因素對(duì)上清液的MCP-1表達(dá)量的影響有顯著性意義(F=31.481,P＜0.001),分組因素對(duì)上清液的MIP-1a表達(dá)量的影響有顯著性意義(F=47.931,p＜0.001)。繼續(xù)行One-Way ANOVA及Dunnett's T3多重比較提示:不同時(shí)間段的MCP-1表達(dá)量不同,除PBS組在12小時(shí)與24小時(shí)之間差異無(wú)顯著性意義外(p=0.383),其余各時(shí)間段之間的兩兩比較,MCP-1表達(dá)量差異均有顯著性意義(p＜0.001)。不同分組,即不同干預(yù)條件對(duì)各時(shí)間段的上清液MCP-1表達(dá)量影響差異有顯著性意義(p＜0.001),多重比較顯示ox-HDL的影響與其他因素單獨(dú)比較,在各時(shí)間段的差異均有顯著性意義(P＜0.05)。 通過上述兩個(gè)章節(jié)實(shí)驗(yàn),我們總結(jié)以下結(jié)論和創(chuàng)新: (1)兔PBMC及BMMC均能在hGM-CSF+hlL-4的作用下經(jīng)過5天的培養(yǎng)被誘導(dǎo)分化為DCs,但PBMC源性的DCs表型表達(dá)的陽(yáng)性率高于BMMC源性的DCs。經(jīng)過LPS的作用,兩種來源的DCs均能轉(zhuǎn)化為成熟樹突狀細(xì)胞; (2)體外培養(yǎng)的兔PBMC源性DCs經(jīng)過ox-HDL的干預(yù),其CD86、MHCⅡ表達(dá)上調(diào),CDl4表達(dá)下調(diào),符合成熟DCs的特征。 (3)通過DiI熒光染料從形態(tài)學(xué)上對(duì)DCs攝取ox-HDL的過程顯示DCs攝取ox-HDL和成熟過程,進(jìn)一步證實(shí)ox-HDL可以被DCs識(shí)別,并通過受體攝取、內(nèi)吞入胞漿中。 (4)兔DCs經(jīng)過ox-HDL的干預(yù),可以增加DCs分泌MCP-1。 (5)ox-HDL對(duì)DCs趨化因子的影響使得DCs遷徙變化,可能參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成。
【圖文】：

源性DC組之間、外周血源性對(duì)照組與骨髓源性對(duì)照組之間比較差異無(wú)顯著性意義(尸)a05)，外周血源性DC組與外周血源性對(duì)照組之間、骨髓源性DC組與骨髓源性對(duì)照組之間比較差異有顯著性意義(尸燈 a001)。(表1一3，圖1一5，1一6)表l一 3Dextron吞噬實(shí)驗(yàn)流式分析結(jié)果(%，丁土·)Tab.l一 3PhenotyPeanalysisofuPtakeofdextranPBMC(n=12)BMMC(n=12)Sum(n=24)之產(chǎn)，，PDC(n=12)27.33士 9.1123.60士 11.5425.47士 10.341.1反歹(t)0.245對(duì)照(n二12)72.57士 15.2275.72士 15.4774.14士 15.230.376(t夕漢710Sum(n二24)49.95士 26.16049.66士 29.8549.81士 27.760.00擴(kuò)廠刀 0.94口之布一189‘t)一Z只灸歹‘t)163.匆夕‘萬(wàn)夕尸，欲818 P0.0000.O0O0.OOJP八二0

2.2.2DCs對(duì)DII標(biāo)記的OxHDL的加工處理和抗原呈遞DCS與DII標(biāo)記的ox一HDL混合孵育2小時(shí)，熒光顯微鏡觀察顯示原本無(wú)色的DCs，在攝取了經(jīng)DII標(biāo)一記的ox一HDL后，胞漿也變的紅染(圖2一IA)，培養(yǎng)2天后，這種情況則顯示更為明顯(圖2一IB)。1)11良好顯示DCs攝取ox一HDL抗原和成熟過程。DCS開始為較小的幼稚多形細(xì)胞，其攝取抗原過程清晰可見，在攝取抗原后逐漸發(fā)育變大，胞漿逐漸豐富，變?yōu)椴灰?guī)則多型狀態(tài)，并有較多偽足伸出。圖2一 1DCS對(duì)DII標(biāo)記的ox一HDL的攝取(K200) F19.2一 1DII一ox一 HDLuPtakenbyDCs(X200)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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10 賈哲;梁健;李宏偉;張弘超;;不同刺激因子對(duì)樹突狀細(xì)胞未成熟狀態(tài)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年02期

本文編號(hào)：2559236