【摘要】： 背景和目的: 腎移植是目前治療終末期腎臟疾病最有效的方法。成功的腎移植可使移植腎具有較高的長期存活率,術(shù)后患者的長期存活率和生活質(zhì)量也高于透析患者。目前,腎移植技術(shù)已日趨成熟,影響移植腎存活率的主要因素是腎移植后排斥反應(yīng)的發(fā)生。免疫抑制劑的問世雖然使腎移植取得了里程碑式的進(jìn)步,但每天給予非特異性免疫抑制劑易引發(fā)二重感染、腫瘤等嚴(yán)重的并發(fā)癥,絕大部分神經(jīng)鈣蛋白抑制劑尚有腎毒性作用。因此,誘導(dǎo)對(duì)移植物的免疫耐受是解決排斥的最理想方法[1],也是當(dāng)今移植學(xué)界研究的熱點(diǎn)。 腎移植排斥反應(yīng)是由于T細(xì)胞的異�；罨�。T細(xì)胞的活化取決于第一信號(hào)與第二信號(hào)(共刺激信號(hào))的共同作用,第一信號(hào)是抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC )提呈的抗原肽-MHC分子( major histocompatibility complex molecules-antigen,MHC-Ag)復(fù)合物與T細(xì)胞表面的受體(T cell receptor,TCR)結(jié)合;第二信號(hào)是T細(xì)胞表面的共刺激分子與APC表面的配體結(jié)合,包括B7-CD28/CTLA4、CD40-CD154等,其中最重要的是由抗原提呈細(xì)胞表面的B7分子與T細(xì)胞表面的CD28/CTLA4結(jié)合產(chǎn)生。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,CTLA4)是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)上的一種跨膜糖蛋白[3]。CTLA4可阻斷B7/CD28共刺激信號(hào)通路,使接受了第一信號(hào)的異體抗原反應(yīng)性細(xì)胞處于無反應(yīng)狀態(tài),甚至于程序性死亡,使細(xì)胞增殖和分化成細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞的作用受抑制,誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞成為對(duì)特異性抗原無反應(yīng)性的T細(xì)胞[1-4]。CTLA4-Ig是將CTLA4的胞外區(qū)與人IgFc段的CH2、CH3及γ區(qū)的氨基酸相結(jié)合而形成的一種融合蛋白,它仍保持與B7結(jié)合的生物學(xué)特性,卻又具有了能溶于水和易于純化的優(yōu)點(diǎn)[15]。 目前,很多研究報(bào)道了無反應(yīng)性T細(xì)胞在體內(nèi)和體外具有特異性免疫抑制活性[5-7]。在人類骨髓移植中,使用無反應(yīng)性T細(xì)胞能降低移植物抗宿主性[8-10,61]。因此,人們推測(cè),應(yīng)用體外產(chǎn)生的無反應(yīng)性T細(xì)胞也能誘導(dǎo)人類實(shí)體器官的同種異體移植物的長期存活。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠作為研究對(duì)象,應(yīng)用CTLA4-Ig阻斷B7/CD28共刺激通路制備無反應(yīng)性T細(xì)胞,將無反應(yīng)性T細(xì)胞通過尾靜脈注射轉(zhuǎn)移到腎移植受體,探討無反應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)同種異體移植腎能否誘導(dǎo)免疫耐受的產(chǎn)生及其機(jī)理。為臨床腎移植排斥反應(yīng)的治療尋找一種新的安全有效的方法。 方法: 1.大鼠脾細(xì)胞混懸液的制備[18]。 2.混合淋巴細(xì)胞反應(yīng):體外加入CTLA4-Ig到以SD大鼠脾細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞和以Wistar大鼠脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中培養(yǎng),檢測(cè)所得混合供受脾細(xì)胞有無增殖,沒有發(fā)生增殖的為無應(yīng)性T細(xì)胞。進(jìn)一步檢測(cè)這些無反應(yīng)性T細(xì)胞在體外能否抑制同種異體活性T細(xì)胞反應(yīng),并檢測(cè)無反應(yīng)性T細(xì)胞的抑制作用能否被rIL-2逆轉(zhuǎn)。 3.構(gòu)建大鼠同種異體原位腎臟移植模型。 4.實(shí)驗(yàn)分組與輸注細(xì)胞:將34只受體SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D四組,A組為實(shí)驗(yàn)組,B、C、D組為對(duì)照組。分組依據(jù)為受體輸注的細(xì)胞種類,A組:輸注(供體脾細(xì)胞+受體脾細(xì)胞+CTLA4-Ig)制備的4×107無反應(yīng)性T細(xì)胞(10只);B組:輸注4×107供受體脾細(xì)胞(10只);C組:輸注(第三方脾細(xì)胞+受體脾細(xì)胞+CTLA4-Ig)制備的4×107無反應(yīng)性T細(xì)胞(8只);D組:輸注1mlPBS(6只)。 5.觀察大鼠移植腎的存活時(shí)間及其組織病理變化:記錄21只受體大鼠移植腎的存活時(shí)間;另13只腎移植術(shù)后第3、11、28、60天,每組每天取一只受體的移植腎制作光鏡切片,觀察組織病理變化,并做Banff系統(tǒng)綜合評(píng)分[60]。 結(jié)果: 1.在供受體脾細(xì)胞的初級(jí)MLR中, CTLA4-Ig抑制了T細(xì)胞的增殖,隨濃度增加抑制能力增強(qiáng),增殖反應(yīng)在CTLA4-Ig10μg/ml時(shí)被完全抑制。而PBS對(duì)照組的MLR發(fā)生了增殖。每個(gè)濃度的增殖值兩兩比較: p0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.無反應(yīng)性T細(xì)胞能抑制相同供受體脾細(xì)胞MLR的增殖,隨無反應(yīng)性T細(xì)胞/混合淋巴細(xì)胞的比率增高,其抑制作用增強(qiáng)。每個(gè)比率的增殖值兩兩比較: p0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.加入rIL-2到無反應(yīng)細(xì)胞和以供體脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞的次級(jí)MLR中,隨rIL-2加入量的增加,其逆轉(zhuǎn)作用增加。且高劑量的rIL-2(100 U/ml),引起了無反應(yīng)狀態(tài)的完全逆轉(zhuǎn)。每個(gè)劑量的增殖值兩兩比較: p0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.大鼠移植腎的平均存活時(shí)間比較:A組大鼠移植腎的平均存活時(shí)間(mean survival time,MST)為(102.0±92.0)天,較B組(10.6±2.3)天、C組(18.6±2.3)天和D組(8.0±1.8)天均明顯延長(p均0.05)。 5.移植腎的組織病理變化:(1)肉眼觀察: A組大鼠移植腎的大小基本正常,表面色鮮紅,均勻、明亮;其它三組移植腎均有明顯的腫脹和出血,體積增大,質(zhì)堅(jiān)而脆,表面呈深紫紅色,呈“大紅腎”。(2)光鏡檢查:A組大鼠移植腎間質(zhì)僅見少量淋巴細(xì)胞及單核樣細(xì)胞浸潤,腎細(xì)小動(dòng)脈無浸潤,腎小球、腎小管基本正常。其它三組均出現(xiàn)急性細(xì)胞性或血管性排斥反應(yīng)。(3)Banff系統(tǒng)綜合評(píng)分: A組大鼠移植腎的總分值低于其它三組,組織學(xué)損傷較其它三組輕(p均0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。 結(jié)論: 1.體外研究表明, CTLA4-Ig阻斷B7/CD28共刺激通路能誘導(dǎo)無反應(yīng)性T細(xì)胞的產(chǎn)生。 2.無反應(yīng)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到同種異體移植受體后,能抑制大鼠腎臟同種異體排斥反應(yīng),延長移植腎的存活時(shí)間。
【圖文】：

正常SD大鼠腎臟病理圖片(HE染色×400)

無反應(yīng)性T細(xì)胞組(HE染色×400)
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2556656