【摘要】： 目的制備抗重組人內(nèi)抑素(Endostatin,ES)單克隆抗體(McAb)并進(jìn)行鑒定,建立雙抗體夾心ELISA法用于人內(nèi)抑素的檢測(cè)。 方法利用重組人內(nèi)抑素為抗原,免疫BALB/c小鼠,應(yīng)用雜交瘤技術(shù)將免疫小鼠的脾細(xì)胞與同源小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行融合,間接ELISA法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行篩檢,對(duì)能穩(wěn)定分泌抗重組人內(nèi)抑素的細(xì)胞株,進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。體內(nèi)誘生法制備腹水并對(duì)其初步鑒定。采用Sigma抗體亞型檢測(cè)試劑盒測(cè)定單克隆抗體的Ig類別和亞型,Western-Blotting,免疫組化等實(shí)驗(yàn)鑒定其免疫學(xué)特性,通過(guò)Protein G Sepharose 4FF層析柱層析純化抗體并進(jìn)行標(biāo)記。選擇多抗和單抗最適包被濃度,對(duì)陰陽(yáng)性血清稀釋度的檢測(cè)。 結(jié)果獲得3B4、1D10、1G5、2D10四株能在體外多次傳代培養(yǎng)后,穩(wěn)定分泌抗重組人內(nèi)抑素McAb的雜交瘤細(xì)胞株,腹水ELISA效價(jià)為10-6-10-4。并對(duì)3B4和1D10兩株給予鑒定,其免疫亞型為IgG2a、IgG3,另兩株雜交瘤細(xì)胞的抗體亞型均為IgG2b。通過(guò)Western-Blotting和免疫組化證明單克隆抗體有識(shí)別ES蛋白的能力。通過(guò)Protein G Sepharose 4FF層析柱層析純化,獲得單一的峰值,并測(cè)的各個(gè)濃度。通過(guò)簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法和戊二醛二步法酶標(biāo)抗體,簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法明顯優(yōu)于戊二醛二步法,簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法效價(jià)可達(dá)到1:6400。利用單抗和多抗組成的雙抗體夾心ELISA法能夠區(qū)別出混合腫瘤病人血清與正常人血清中的ES含量。 結(jié)論本研究利用雜交瘤技術(shù)制備了四株抗重組人內(nèi)抑素單克隆抗體,并進(jìn)行鑒定,證明抗體識(shí)別ES蛋白有的一定得特異性和敏感性;后經(jīng)protein G Sepharose 4FF親和層析柱層析純化,并進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記單克隆抗體,通過(guò)直接ELISA法證明酶標(biāo)抗體具有較高的效價(jià)。本研究通過(guò)自己制備的多抗和單抗組成的雙抗體夾心ELISA法能夠區(qū)別混合腫瘤病人血清與正常人混合血清,此結(jié)果為我們下一步的實(shí)驗(yàn)奠定了的基礎(chǔ),確定了方向。
【圖文】：

4圖11圖11 四株單抗腹水經(jīng)protein G Sepharose 4FF提純后形成的各峰值4.4 酶標(biāo)記抗體的效果測(cè)定 根據(jù)紫外分析儀測(cè)得結(jié)果，并計(jì)算，比較二種酶標(biāo)方法，顯示簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法比戊二醛二步法優(yōu)。見(jiàn)表-1

此為雜交瘤細(xì)胞，如箭頭所指。其中圖 1，為融合后第五天，圖 2，融合后第十二天細(xì)胞生長(zhǎng)情況。如圖 不同時(shí)期的雜交瘤細(xì)胞形態(tài)(×40)圖1 圖2圖1 箭頭指為，在HAT培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞.圖2 單個(gè)細(xì)胞形成的集落Fig 1 Arrowhead shows, only hybridoma cell grow in the HAT culture.Fig 2 Cell lines generated by a single cell3.5 抗 ES 單克隆抗體的免疫球蛋白類別及亞型鑒定參照Sigma公司抗體亞型檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用Antigen-Mediated ELISA 法測(cè)定單克隆抗體的Ig類別和亞型。穩(wěn)定分泌的細(xì)胞株分別是1D10、3B4，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的免疫球蛋白亞型鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定，分別為IgG3、IgG2a。1G5、2D10亞型均為IgG2b。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392;R446.6

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 宋芳;周玉;盧士英;任洪林;李巖松;柳增善;劉文迪;郝亞明;;β-酪蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué);2011年08期

2 呂大偉;;抗體的臨床應(yīng)用及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的抗體治療[J];中國(guó)醫(yī)藥指南;2011年22期

3 裴冀男;;單克隆抗體制備例談[J];高中生學(xué)習(xí)(高二版);2011年05期

4 謝曉玲;;惡性血液腫瘤的單克隆抗體靶向治療[J];中外醫(yī)學(xué)研究;2011年18期

5 孫厚良;魏大鵬;張小洪;劉彥君;章崇杰;;抗hMOF單克隆抗體的制備與鑒定[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年05期

6 ;新藥速遞[J];藥學(xué)與臨床研究;2011年04期

7 羅莎;;單克隆抗體成功治療由出血性大腸桿菌引起的溶血性尿毒綜合癥[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2011年03期

8 孔桂美;張小榮;黃瑤;高巍;廖月霞;卜平;;人VEGF受體Ⅱ胞外Ⅲ區(qū)單克隆抗體研制與生物學(xué)活性測(cè)定[J];揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版);2011年02期

9 曹黎黎;劉丹丹;衛(wèi)娜;高明春;王君偉;;牛IFN-γ單克隆抗體的制備及鑒定[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2011年07期

10 杜春紅;王鵬;張建中;唐雪;宋志忠;;鼠疫耶爾森氏菌Pla蛋白單克隆抗體的制備與鑒定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2011年09期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 徐爽;徐焱;;單克隆抗體在輸血領(lǐng)域的應(yīng)用探討[A];中國(guó)輸血1999年年會(huì)暨紀(jì)念A(yù)BO血型發(fā)現(xiàn)100周年學(xué)術(shù)交流論文專輯[C];1999年

2 李安民;;單克隆抗體標(biāo)載的~(131)I治療惡性腦膠質(zhì)瘤Ⅱ期臨床試驗(yàn)的三種給藥途徑的研究[A];第一屆中國(guó)腫瘤靶向治療技術(shù)大會(huì)論文集[C];2003年

3 于翠;施曼鈴;王桂珍;吳建祥;周雪平;;幾種重要植物病毒單克隆抗體的制備和快速檢測(cè)方法的建立[A];第三次全國(guó)植物病毒和病毒防治學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2003年

4 劉振勇;鄧國(guó)華;李呈軍;張立春;田國(guó)彬;何后軍;于康震;陳化蘭;;抗禽流感H9N2亞型血凝素特異性單克隆抗體的制備與分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會(huì)暨中國(guó)免疫學(xué)會(huì)獸醫(yī)免疫分會(huì)第六次研討會(huì)論文集[C];2005年

5 李振宇;趙益明;董寧征;沈飛;阮長(zhǎng)耿;;抗FⅧ-C2區(qū)單克隆抗體的制備及鑒定[A];第11次中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文匯編[C];2007年

6 張改連;黃烽;;抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體rituximab治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床研究[A];第十二屆全國(guó)風(fēng)濕病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

7 郝波;張國(guó)新;林艷;楊楊;王宏娣;;抗HCCR單克隆抗體的制備及其在肝癌檢測(cè)中的初步應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)消化病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（下冊(cè)）[C];2007年

8 陶薇;楊連華;何卓晶;洪艷;陳勇;;抗戊型肝炎病毒重組蛋白單克隆抗體的制備和鑒定[A];浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)及醫(yī)學(xué)病毒學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

9 馬翠卿;郭奕陽(yáng);顧海燕;曾瑞紅;楊麗娟;魏林;;一株抗A族鏈球菌表面蛋白Fba的單克隆抗體對(duì)應(yīng)的表位與Fba結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白FH的位點(diǎn)重疊[A];河北省免疫學(xué)會(huì)第六次免疫學(xué)大會(huì)資料匯編[C];2010年

10 楊天兵;沈倍奮;;抗人重組白細(xì)胞介素1(rHIL-1)單克隆抗體的研制[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第五次會(huì)議論文摘要匯編[C];1992年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 文來(lái);2010年單克隆抗體市場(chǎng)有望擴(kuò)三倍[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

2 莊愉;單克隆抗體異軍突起[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2003年

3 ;單克隆抗體異軍突起[N];中國(guó)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2003年

4 記者 尹暉;單克隆抗體研發(fā)進(jìn)入新階段[N];無(wú)錫日?qǐng)?bào);2010年

5 尹暉;最大單克隆抗體研制項(xiàng)目在馬山奠基[N];無(wú)錫日?qǐng)?bào);2010年

6 記者 馬波;滇將建首家單克隆抗體基地[N];科技日?qǐng)?bào);2000年

7 ;單克隆抗體應(yīng)用前景看好[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2002年

8 探微;單克隆抗體技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用初探[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

9 毛文波;單克隆抗體：征服癌癥的新方法[N];科技日?qǐng)?bào);2004年

10 勞云信;單克隆抗體 抗擊腫瘤的生力軍[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 唐琳;肝再生增強(qiáng)因子與肝癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2005年

2 侯桂華;巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子在同種移植排斥中作用及其機(jī)理的研究[D];山東大學(xué);2004年

3 高勇;新型單克隆抗體熒光探針染料的合成及免疫熒光組織化學(xué)應(yīng)用[D];西北大學(xué);2006年

4 江敏;大鼠單克隆抗體的制備、鑒定、基因克隆、抗原分析以及藥物偶聯(lián)物的抗腫瘤作用研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1996年

5 秦迎松;人促血液血管細(xì)胞生成素（Haemangiopoietin, HAPO）單克隆抗體的制備、鑒定及應(yīng)用[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2004年

6 萬(wàn)忠海;抗PEA單抗和單鏈抗體制備及在綠膿感染中的應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2008年

7 呂大偉;抗RANKL單克隆抗體在大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中的應(yīng)用及RANKL轉(zhuǎn)錄調(diào)控的探索性研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2011年

8 莊國(guó)洪;抗DR4、DR5單克隆抗體誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株凋亡的研究[D];吉林大學(xué);2004年

9 付建芳;溶藻弧菌抗獨(dú)特型抗體基因工程疫苗的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

10 王曉潔;對(duì)蝦白斑癥病毒快速檢測(cè)試劑盒的研制及其應(yīng)用[D];中國(guó)海洋大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 魏文杰;抗重組人內(nèi)抑素單克隆抗體的制備、鑒定及檢測(cè)人內(nèi)抑素ELISA方法的建立[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2009年

2 黃子逸;LIGHT基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和單克隆抗體的研制及其對(duì)T細(xì)胞的共刺激效應(yīng)[D];蘇州大學(xué);2010年

3 李鐵民;抗P-選擇素單克隆抗體對(duì)大鼠胰腺缺血再灌注損傷的作用實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2003年

4 李曉龍;肝癌相關(guān)抗原SMP30 mRNA在癌細(xì)胞中的表達(dá)及其單克隆抗體的制備[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2010年

5 鄭杰;分泌抗豬流感病毒（河南株）單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備、鑒定和初步應(yīng)用[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

6 邵煒慧;鹽酸克倫特羅單克隆抗體的研制及初步應(yīng)用[D];揚(yáng)州大學(xué);2005年

7 楊寧;納豆激酶的純化及其單克隆抗體的制備鑒定[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

8 唐琦;抗麻痹性貝毒素GTX2，3單克隆抗體的制備及特性分析[D];暨南大學(xué);2005年

9 賈娟娟;抗胰島素單克隆抗體的研制及酶聯(lián)免疫分析方法的建立[D];中國(guó)原子能科學(xué)研究院;2005年

10 李彬;TLR4單克隆抗體誘導(dǎo)同種心臟移植免疫耐受的研究[D];蘇州大學(xué);2010年

，

本文編號(hào)：2556733