【摘要】：背景： 布魯氏菌在我國為乙類病原微生物,主要引起布魯氏菌病,簡稱布病,是目前世界上流行最廣、危害最大的人獸共患病之一。布病可引起動物的流產(chǎn)和不孕,引起人急性波狀熱等,容易轉(zhuǎn)入慢性引起肝脾、淋巴結(jié)腫大,關(guān)節(jié)炎等變態(tài)反應(yīng)性疾病。有部分病例表明布病可導(dǎo)致孕婦流產(chǎn),甚至還出現(xiàn)母嬰垂直傳播。據(jù)統(tǒng)計資料表明,全世界每年約有50萬人感染布魯氏菌病,每年因該病造成的經(jīng)濟損失近30億美元,而中國處于人間布病發(fā)病率超過1/10萬的國家之一,為布病“重災(zāi)區(qū)”國家,主要威脅寧夏、新疆、浙江、山西、甘肅、遼寧、上海、青海、河北、江蘇等約28省。據(jù)中國CDC報告,2005～2008年全國布病新發(fā)病人分別為18416、19013、21901、30002例,2006年、2007年發(fā)病數(shù)上升到全國甲類、乙類傳染病發(fā)病數(shù)順位的第10位。2009年(37734例)發(fā)病人數(shù)超過3.5萬,達歷史新高。但2012年最新CDC的統(tǒng)計報告顯示發(fā)病人數(shù)已接近4萬,至39875人,以平均每年10%的速率上升,赫然成為最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。在人感染布菌中,80%以上是通過接觸感染羊及其產(chǎn)品導(dǎo)致的。因此,預(yù)防人的布病首要是預(yù)防羊布菌感染。 布魯氏菌是一種能引起變態(tài)反應(yīng)的兼性胞內(nèi)寄生菌,主要寄生在一些專職和非專職吞噬細胞中,如巨噬細胞和上皮細胞等。據(jù)不完全統(tǒng)計,世界上有近60種野生動物對布魯氏菌侵襲可產(chǎn)生各種血清學反應(yīng),近30種野生動物身上寄生了各生物種的布魯氏菌。在我國流行的主要為羊、牛、和豬種,羊種(B.melitensis)占流行株80%,牛種(B. abortus)占10%,豬種(B. suis)不到1%。B. melitensis是綿羊和山羊的致病菌,也是對人毒力最強、危害最大的亞種。 布魯氏菌病臨床癥狀復(fù)雜,引起的發(fā)熱、流產(chǎn)等病理損害易與某些常見疾病混淆；醫(yī)生很難單憑有無病畜接觸史來診斷布氏菌感染,給診斷帶來了一定的困難,容易導(dǎo)致誤診,造成慢性感染。另一方面缺乏有效的治療手段,抗生素的大量長期使用仍很難見效,且容易引起耐藥性問題。因此,布魯氏菌的疫苗預(yù)防和早期快速診斷對布菌的防控具有重大的現(xiàn)實意義；其中疫苗的免疫效果和布菌診斷的準確性就顯得尤為重要。 預(yù)防布病的疫苗,必須能有效誘導(dǎo)以產(chǎn)生IFN-γ為特征的Thl型細胞免疫反應(yīng),尤其是CTL介導(dǎo)的細胞毒效應(yīng)。羊種布菌疫苗M5-90是我國自主研發(fā)用于綿羊和山羊接種的減毒活疫苗,免疫效果相對較好。但是缺乏其在天然宿主羊免接種后,體液和細胞免疫反應(yīng)水平及免疫保護效果的相關(guān)研究,并且M5-90疫苗株也存在兩個缺陷：一是免疫動物與自然感染動物不能區(qū)別,嚴重影響了布病的診斷和檢疫；二是疫苗毒力較強,可引起部分孕畜流產(chǎn)。因此,研制一種新型的毒力低、免疫效果好、能進行鑒別診斷的分子標記疫苗勢在必行。 目前,國內(nèi)外傾向于采用基因工程的手段對布菌現(xiàn)有疫苗進行改造。國外曾有研究報道了羊種布菌疫苗株Rev.1BP26基因缺失株(CGV26)并發(fā)現(xiàn)其仍具有免疫保護效果。但是,國內(nèi)研究人員對M5-90菌株進行改造,敲除BP26得到新的突變株M5Δbp26,其毒力有所下降,但免疫應(yīng)答弱于原疫苗株,持續(xù)時間短,免疫效果達不到要求；相似的情況還出現(xiàn)在Rev.1的omp31缺失株中。由此推斷,BP26和OMP31蛋白可能與疫苗株毒力和保護性抗原相關(guān),若將M5-90疫苗株攜帶的BP26基因全部敲除,則影響弱毒疫苗株的免疫效果。 BP26蛋白布菌的一種外膜間質(zhì)蛋白,在布菌多數(shù)亞種中具有高度的保守性。在感染的牛,綿羊,山羊和人中是一種免疫顯性優(yōu)勢抗原,可作為動物和人布病的診斷抗原,準確率可達到86%以上。OMP31為膜孔蛋白,其基因序列在不同的種屬之間的同源性高達98%以上,在牛種菌中缺失,在羊種和豬種之間存在大約9個核苷酸的差異,并存在氨基酸序列的改變,故OMP31的單克隆抗體可能能夠鑒別診斷不同生物型的布魯氏菌感染。因此,我們設(shè)想在保留M5-90中BP26和OMP31蛋白的保護性抗原表位前提下,針對這兩蛋白抗原表位及毒力相關(guān)位點進行分子修飾或改造,構(gòu)建分子標記的弱毒疫苗株,提高布魯氏菌疫苗免疫保護效果,并建立表位Peptide-ELISA診斷方法解決免疫與野生菌株感染的鑒別診斷技術(shù)難題。 目的： 本研究旨在測定布菌M5-90疫苗弱毒株在免疫羊后的體液和細胞免疫保護應(yīng)答,揭示布菌M5-90弱菌毒株優(yōu)勢蛋白BP26和OMP31蛋白T和B細胞抗原表位,評估其與免疫保護效果相關(guān)性,最終繪制出M5-90主要蛋白抗原表位及其宿主MHC限制性圖譜,給弱毒疫苗株的基因工程改造提供實驗數(shù)據(jù)支持。 方法： 實驗采用試管凝集和虎紅平板凝集實驗和ELISA檢測M5-90疫苗菌免疫前0個月和免疫后0.5,1,2,2.5,7.5個月抗體的變化,以檢測免疫后體液免疫效果。采用IFN-γ的酶聯(lián)免疫斑點印跡檢測技術(shù)(ELISpot),使用BP26和OMP31的重疊多肽刺激免疫前和免疫后0.5,1,2,2.5,7.5個月的羊PBMCs,檢測分泌IFN-γ的T細胞數(shù)量變化,以反映疫苗免疫后機體的細胞免疫保護應(yīng)答效果。根據(jù)免疫后進行的IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點印跡檢測結(jié)果,篩選能特異性刺激T淋巴細胞產(chǎn)生IFN-γ,的多肽,即BP26或OMP31蛋白的T細胞表位。 采用原核表達技術(shù),制備M5-90菌株重組OMP31(rOMP31)蛋白。以rOMP31蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠,采用鼠脾細胞與骨髓瘤細胞雜交瘤技術(shù)制備OMP31單克隆抗體。以M5-90菌株提取的含天然OMP31的膜蛋白(NMP)和菌體破碎上清為抗原,采用Western Blot和ELISA方法測定制備的單克隆抗體的特性；以合成的OMP31重疊多肽,采用Peptide-ELISA方法篩查和鑒定單克隆抗體識別的抗原表位。 結(jié)果： 1)疫苗免疫效果測定：實驗測定了M5-90疫苗株免疫后的美利奴羊和哈薩克羊的體液和細胞免疫應(yīng)答水平。發(fā)現(xiàn)M5-90疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體,在疫苗接種后0.5個月的凝集(SAT)抗體達到高峰,隨之快速下降并對加強免疫無明顯反應(yīng)；相反,針對外面蛋白的ELISA抗體長時間保持較高水平。細胞免疫應(yīng)答方面,M5-90疫苗接種能夠誘導(dǎo)T細胞免疫分泌特異性INF-γ,部分強勢表位反應(yīng)性強,但總體水平低,持續(xù)時間短,可能與Treg細胞快速活化和增殖相關(guān)。 2)BP26和OMP31蛋白T細胞表位篩查：利用重疊多肽的ELISpot實驗對BP26和OMP31的抗原T細胞表位進行測定,篩選出19個反應(yīng)多肽(BP2610條,OMP319條),其中含10個高頻率共同性或優(yōu)勢表位多肽,分別為BP26-06:42VTGEGMMTASPDMAIL57, P26-08:60SVLRQAKTAREAMTAN75, P26-11:87KKAGIEDRDLQTGGIN102, P26-12:96LQTGGINIQPIYVYPD111和OM P31-09:69EQVSGSLDVTAGGFVG84, OMP31-14:114SISAGASGLEGKAETK129, OMP31-17:141GYTATERLMVYGTGGL156, OMP31-18:150VYGTGGLAYGK VKSAF165, OMP31-23:195INNNWTLKSEYLYTDL210, OMP31-26:222FLESKV NFHTVRVGLN237。這些多肽可以誘導(dǎo)兩種不同品系免疫羊的T細胞反應(yīng)。 篩選出5個品系特異性表位多肽,包括BP26-10:78AMTKVLDAMKKAG IED93, BP26-18:150LGVNQGGDLNLVNDNP174, BP26-21:177VANAIAKAKTL ADAAG192, BP26-22:186TLADAAGVGLGRVVEI201和OMP31-12:96NGVVLG AETDFQGSSV111。這些表位多肽誘導(dǎo)單一品系免疫羊產(chǎn)生特異性INF-y分泌。 篩選出4個低頻率的個體差異性表位多肽包括：BP26-15:123GYSVSTSLTVRVRELA138, BP26-23:195LGRVVEISELSRPPMP210, OMP31-06:42GGYIGIN AGYAGGKFK57, OMP31-21:177WSDKTKAGWTLGAGAE192。這兩個表位多肽誘導(dǎo)個別免疫羊產(chǎn)生T細胞應(yīng)答反應(yīng)。 為了分析T細胞表位多肽與宿主遺傳免疫限制的相關(guān)性,實驗對11只免疫羊進行了MHC I等位基因全序列和MHC II DRB1exon2等位基因序列的多態(tài)性分析。 3) OMP31蛋白B細胞表位篩查：以重組OMP31蛋白,制備了22株能夠識別羊布氏菌M5-90弱毒疫苗天然oMP31抗原的單克隆抗體,包括了11株IgG2a、5株IgGl和6株IgM三種亞型,識別線性,半構(gòu)象和構(gòu)象三種B細胞抗原表位。新發(fā)現(xiàn)了5個B細胞線性表位,分別為OMP31-05:33APVDTFSWT GGYIGIN48, OMP31-11:87QAGYNWQLDNGVVLGA102, OMP31-20:168GDDA SALHTWSDKTKA183, OMP31-21:177WSDKTKAGWTLGAGAE192, OMP31-24:204EYLYTDLGKRNLVDVD219.其中OMP31-21同為T細胞表位。 4)BP26與OMP31抗原T和B細胞表位簡圖：根據(jù)BP26與OMP31抗原對M5-90免疫羊T細胞或重組蛋白免疫小鼠B細胞的反應(yīng),繪制了實驗室初步測定的T和B細胞表位簡圖并進行了描述。 結(jié)論： 1)M5-90疫苗免疫羊產(chǎn)生的SAT抗體持續(xù)時間短,水平低,而ELISA抗體長時期保持高位。 2)M5-90疫苗免疫可以誘導(dǎo)特異性T細胞免疫反應(yīng),在免疫后1個月達到高峰,隨之快速下降,總體水平較低,持續(xù)時間較短。 3)M5-90疫苗免疫同時誘導(dǎo)Treg細胞增殖,抑制保護性T細胞免疫反應(yīng),可能是造成疫苗免疫保護效率低的原因之一。 4)篩選出10個BP26和OMP31的高頻率共同性或優(yōu)勢表位多肽,5個品系特異性表位多肽和4個個體特異性表位多肽。 5)分析了實驗羊MHC I和MHC Ⅱ DRB1Exon2等位基因的多態(tài)性與T細胞表位多肽反應(yīng)的相關(guān)性。 6)制備了22株OMP31抗原單克隆抗體,50%為IgG2a,可識別線性,半構(gòu)象和構(gòu)象B細胞抗原表位。 7)揭示了5個OMP31的B細胞線性表位。 8)繪制了BP26與OMP31抗原T和B細胞表位簡圖。 9)實驗結(jié)果對M5-90弱毒菌疫苗株分子改造提供了有意義的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392

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