【摘要】： 星形膠質(zhì)細胞(Astrocyte)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system, CNS)中數(shù)量最多的一種膠質(zhì)細胞。最初認為,星形膠質(zhì)細胞可作為大腦的填充細胞,支持和保護神經(jīng)元。但越來越多的研究證明星形膠質(zhì)細胞還可通過調(diào)節(jié)細胞外液離子濃度、pH值、葡萄糖水平和清除神經(jīng)遞質(zhì)等活動參與神經(jīng)元微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持,并且在促進突觸形成、維護突觸正常功能,調(diào)控神經(jīng)元信息,調(diào)節(jié)腦血管緊張性,調(diào)節(jié)免疫功能及成年神經(jīng)發(fā)生中均起作用。這些發(fā)現(xiàn)提示星形膠質(zhì)細胞即使受到輕微的損傷也可能引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。實際上,星形膠質(zhì)細胞與很多神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病有關(guān)。因此,星形膠質(zhì)細胞已經(jīng)成為近年來大家關(guān)注的焦點。 星形膠質(zhì)細胞在應對各種損傷時發(fā)生活化,稱為反應性星形膠質(zhì)細胞,表現(xiàn)為損傷局部星形膠質(zhì)細胞增殖、胞體肥大、突起增多、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein, GFAP)表達上調(diào),伴隨這些形態(tài)學的變化,細胞還發(fā)生一系列生理功能的改變,包括分泌各種生長因子、細胞因子和釋放細胞毒性物質(zhì),如：一氧化氮(Nitric oxide, NO)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α))、白細胞介素-1β(Interlukin 1β, IL-1β)和IL-6等。活化的星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元起保護或毒性作用,從而發(fā)揮“雙刃”效應。因此,將星形膠質(zhì)細胞作為治療CNS系統(tǒng)疾病靶點具有挑戰(zhàn)性,選擇性地作用于星形膠質(zhì)細胞,盡量減少損害是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病最理想策略。但是由于星形膠質(zhì)細胞的雙重角色,增加了治療的難度。 鈣是重要的胞內(nèi)信使,在可興奮細胞和非興奮細胞的功能活動中均發(fā)揮重要作用。星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Ca2+濃度增加是細胞“興奮”的一種表現(xiàn)。在帕金森病(Parkinson's disease, PD)、阿爾茨海默氏癥(Alzheimer's disease, AD)以及亨廷頓病等神經(jīng)變性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中,鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變。鈣穩(wěn)態(tài)失衡和異常的鈣信號可能是星形膠質(zhì)細胞活化的一個關(guān)鍵因素。TRPC(Canonical transient receptor potential, TRPC)通道是一類非選擇性鈣離子通道,能夠感受細胞內(nèi)外的多種刺激。TRPC通道包括7個亞族,即TRPC 1-7。近年來的研究表明,TRPC通道作為一類新發(fā)現(xiàn)的Ca2+通道,在調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+平衡、傳遞胞外信號方面發(fā)揮重要作用。星形膠質(zhì)細胞上有TRPC 1-7基因表達,其中TRPC1和TRPC3表達水平較高。研究證實,TRPC3參與多種疾病的病理生理過程,但是否參與CNS疾病過程中星形膠質(zhì)細胞的活化,目前尚未見報道。 脂多糖(liposaccharide, LPS)是革蘭氏陰性桿菌細胞壁的主要成分,LPS主要與TLR4 (Toll-like receptor 4, TLR4)結(jié)合,引起CNS炎癥反應。本課題在上述理論的基礎(chǔ)上,應用LPS建立體外星形膠質(zhì)細胞活化模型,通過熒光定量PCR、Western blot和免疫熒光細胞化學技術(shù)檢測TRPC3在星形膠質(zhì)細胞上表達的變化,應用共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度變化。同時通過藥理學方法阻斷TRPC通道的活性,觀察細胞增殖、GFAP表達、IL-6分泌及[Ca2+]i變化,進一步闡明TRPC3在星形膠質(zhì)細胞活化中的作用,為研究神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病的發(fā)病機制和治療提供新的理論依據(jù)。 首先,我們觀察LPS對培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞增殖的影響。我們分別觀察了不同劑量LPS和LPS作用不同時間后的效果。依據(jù)參考文獻,我們觀察0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml不同濃度的LPS作用48 h細胞增殖情況。MTS和BrdU實驗結(jié)果顯示,星形膠質(zhì)細胞增殖隨LPS濃度的增加而增加,與對照組相比,細胞活性分別增加了32.00%、44.69%、48.17%、58.45%和55.20%(p0.01),而BrdU陽性細胞百分比分別增加了33.88%、37.71%、49.10%、53.66%和39.62%(p0.01)。由此可見,LPS呈劑量依賴性促進星形膠質(zhì)細胞增殖。我們選擇0.5μg/ml LPS來觀察LPS作用不同時間后對星形膠質(zhì)細胞活性的影響。0.5μ/ml LPS作用24 h和48 h后,星形膠質(zhì)細胞活性分別為146.37%和155.36%,而不加LPS的細胞正常培養(yǎng)24 h和48 h后,其活性分別為119%和124.08%,LPS作用24 h和48 h均能顯著增加細胞活性(p0.05)。因此,后續(xù)細胞增殖實驗選用0.5μg/ml LPS作用48 h。 GFAP是星形膠質(zhì)細胞的骨架蛋白,被公認為是星形膠質(zhì)細胞活化的特征性標記物,在病理狀態(tài)下出現(xiàn)反應性上調(diào),其上調(diào)機制尚未完全闡明。接下來我們通過觀察0.5μg/ml LPS分別作用2 h、6h、12h、24 h、48 h后星形膠質(zhì)細胞GFAP的表達情況來了解細胞活化的情況。Western blot實驗結(jié)果顯示,0.5ug/ml LPS作用2h后,GFAP表達顯著增加,LPS作用2-48 h后星形膠質(zhì)細胞中GFAP的表達分別為對照組的2.16倍、2.03倍、2.36倍、2.31倍、2.30倍(p0.01)。免疫熒光細胞化學實驗結(jié)果顯示,LPS作用星形膠質(zhì)細胞2h后胞漿GFAP熒光明顯增強,一直持續(xù)到48 h,進一步證實LPS可誘導GFAP表達。 IL-6為大家熟悉的免疫炎性因子,為檢測星形膠質(zhì)細胞活化后是否通過釋放IL-6參與炎癥反應,我們檢測了LPS對星形膠質(zhì)細胞中IL-6變化的影響。實驗結(jié)果顯示,生理情況下,IL-6分泌量很低,為1.90 pg/ml.LPS作用2h后即升高到32.02 pg/ml(p0.01),并隨實驗時間延長分泌持續(xù)升高,LPS作用48 h后升高到242.58 pg/ml.提示LPS能夠促進炎性細胞因r IL-6的分泌。 以上實驗證明致炎因子LPS可引起星形膠質(zhì)細胞活化,表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細胞增殖、GFAP表達上調(diào)及IL-6的分泌增加。 由于TRPC通道是非選擇性陽離子通道,能夠介導胞外Ca2+內(nèi)流,使細胞內(nèi)鈣離子濃度(Intracellular calcium concentration,[Ca2+]i)升高,而[Ca2+]i升高是星形膠質(zhì)細胞興奮的標志。我們接下來觀察LPS對星形膠質(zhì)細胞TRPC3的影響。用熒光定量PCR.Western blot和免疫熒光細胞化學技術(shù)檢測LPS對TRPC3表達的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.5 ug/ml LPS處理2 h后,TRPC3 mRNA和蛋白表達水平即升高,一直持續(xù)到48 h。LPS處理2-48 h后,TRPC3 mRNA表達水平分別為對照組的3.47倍、6.2倍、6.24倍、7.44倍和3.33倍,蛋白表達水平分別為對照組的1.84倍、2.25倍、2.32倍、2.45倍和1.91倍。免疫熒光實驗顯示,正常星形膠質(zhì)細胞胞漿和核內(nèi)均有TRPC3表達,核內(nèi)表達水平較高,而LPS誘導胞漿和核內(nèi)TRPC3表達增強。這提示TRPC3可能參與了LPS誘導的星形膠質(zhì)細胞活化。 為驗證TRPC3是否參與LPS誘導的星形膠質(zhì)細胞活化反應,我們利用2-APB和SKF96365兩種TRPC通道阻斷劑來觀察LPS對星形膠質(zhì)細胞增殖、GFAP表達和IL-6分泌的影響。MTS和BrdU結(jié)果顯示,2-APB和SKF96365呈劑量依賴性抑制LPS誘導的星形膠質(zhì)細胞增殖。與LPS組相比,不同濃度2-APB組細胞活性分別降低到128.77%、127.92%、114.01%、111.78%和107.60%,BrdU陽性細胞百分比降低到152.07%、140.45%、129.22%、119.42%、107.48：而不同濃度SKF96365組細胞活性分別降低到139.26%、127.08%、126.82%、122.56%和116.83%, BrdU陽性細胞百分比降低到127.42%、127.90%、126.32%、122.12%和108.09%。流式細胞儀檢測進一步顯示,LPS能誘導G0／G1期細胞進入S期和M期,而10μM 2-APB和5μM SKF96365使細胞停滯在G0／G1期(p0.01),從而抑制LPS誘導的細胞增殖。同樣,我們觀察了2-APB和SKF96365兩種TRPC通道阻斷劑處理后對星形膠質(zhì)細胞特異性標記蛋白GFAP表達的影響。結(jié)果顯示,10μM 2-APB可以使GFAP的表達由LPS組的2.50倍降低到1.58倍(p0.01),而5μM SKF96365可以使GFAP的表達由LPS組的3.17倍降低到1.97倍(p0.05)。提示2-APB和SKF96365通過抑制TRPC通道的作用從而阻斷LPS引起的星形膠質(zhì)細胞GFAP表達。MTS實驗和DAPI染色顯示,2-APB (10μM)和SKF96365 (5μM)對正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞沒有毒性,也不影響GFAP的表達。此外,2-APB和SKF96365可以影響IL-6的分泌水平,其中2-APB可使IL-6分泌水平由LPS誘導后的362.05 pg/ml降低到142.73 pg/ml (p0.01), SKF96365可以使其降低到224.34 pg/ml (p0.05).提示抑制TRPC通道的作用可以阻斷LPS引起的星形膠質(zhì)細胞IL-6的分泌。 由于TRPC通道與[Ca2+]i變化關(guān)系密切,我們首先觀察LPS急性作用后,星形膠質(zhì)細胞[Ca2+]i的變化,用相對熒光強度表示。結(jié)果顯示,灌流液存在1.3mM Ca2+時,5μg/ml LPS引起瞬時[Ca2+]i升高并維持在較高水平,而在無鈣灌流液中,LPS僅誘導瞬時[Ca2+]i升高,表明LPS誘導的瞬時[Ca2+]i升高是由細胞內(nèi)鈣釋放引起,而隨后出現(xiàn)的持續(xù)[Ca2+]i升高是由胞外鈣內(nèi)流所致。100μM2-APB既可抑制胞內(nèi)鈣釋放,也可以抑制胞外的鈣內(nèi)流,而100μM SKF96365只能抑制胞外鈣內(nèi)流。上述結(jié)果提示LPS誘導的胞外鈣內(nèi)流可能與TRPC通道有關(guān)。 綜上所述,LPS能促進星形膠質(zhì)細胞增殖、GFAP表達和炎癥因了IL-6釋放,促進[Ca2+]i升高,TRPC3表達上調(diào)。TRPC通道阻斷劑2-APB和SKF96365可抑制LPS誘導的持續(xù)[Ca2+]i升高,并抑制LPS對星形膠質(zhì)細胞的活化作用。因此,我們推測致炎因了引起星形膠質(zhì)細胞活化的機制可能與TRPC3表達上調(diào),鈣離子內(nèi)流增加有關(guān),提示TRPC3可能在與星形膠質(zhì)細胞活化相關(guān)的CNS炎癥性疾病中起重要作用。
【圖文】：

1.星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)及鑒定分離的大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞在種植展。培養(yǎng)3一4d后，細胞數(shù)量增多Zh后大多數(shù)均己貼壁，部分細胞開胞體明顯增大，有的細胞突起逐漸伸。至第10d，細胞長滿培養(yǎng)瓶壁，倒置相差顯微鏡下見細胞分為兩層，星形質(zhì)細胞作為底層，其他細胞則生長在星形膠質(zhì)細胞層之上(圖IA)，提示原培養(yǎng)細胞以星形膠質(zhì)細胞為主，并含有小膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和少量的寡突膠細胞。經(jīng)搖床篩選純化后觀察到星形膠質(zhì)細胞呈片聚集性生長，形成膠質(zhì)網(wǎng)，未見細胞分層現(xiàn)象(圖IB)。第2代細胞使用特異性G隊P抗體進行熒光細免疫鑒定呈陽性，結(jié)果顯示GFAP表達主要位于胞漿和突起內(nèi)，胞核呈空泡，不顯色。熒光陽性細胞統(tǒng)計在99%以上(圖2)，，可見培養(yǎng)純化的星形膠細胞陽性率已達實驗要求。

圖2.第二代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞純度鑒定。A:紅色熒光為星形膠質(zhì)細胞特異性標記物G隊P，B:藍色熒光為非特異性細胞核標記(DAPI)染色，C為同一視野兩種標記物相復合圖。Fig2.IdentificationofPurityinastroeyteeulture.A:redfluoresceneerePresentsastroeytemarker(GFAP);B:bluefluoreseeneerePresentsnon一sPecifienuelear(DAPI):C:thePicturerePresentsamergebetweenGFAPandDAPI.40x.
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 史娟,李繼碩;TRP離子通道[J];神經(jīng)解剖學雜志;2004年02期

2 高艷琴,高慧,周正怡,陸世鐸,孫鳳艷;大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后紋狀體和海馬區(qū)瞬時受體電位通道蛋白4的表達增加[J];生理學報;2004年02期

本文編號：2555045