【摘要】： 霍亂弧菌是霍亂的病原體,其兩個(gè)主要的毒力決定子是霍亂毒素CT和毒素共調(diào)菌毛TCP,CT能夠引起霍亂樣的腹瀉,TCP則是霍亂弧菌能夠黏附并定植在小腸上皮的必要條件。大量的研究表明,復(fù)雜的調(diào)控級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)著霍亂弧菌這些毒力基因的表達(dá)。其中,霍亂弧菌毒力基因ctxAB和tcpA均受到霍亂弧菌主要的直接轉(zhuǎn)錄激活子ToxT的調(diào)控,ToxT屬于AraC/Xyls家族。除此之外,ToxT還能抑制msh操縱子的轉(zhuǎn)錄。而ToxT的表達(dá)又受ToxR和另外一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子TcpP的共同調(diào)控。并且,ToxR還可激活外膜蛋白基因ompU、抑制外膜蛋白基因ompT的轉(zhuǎn)錄。本課題中,我們研究了霍亂弧菌關(guān)鍵毒力調(diào)控子ToxR在不同條件下的表達(dá)水平,并發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)平臺(tái)期,與野生株相比,aphB缺失株中toxR的表達(dá)降低。AphB之前已經(jīng)被證明能夠和AphA相互作用共同激活tcpP,本研究中電泳遷移率變動(dòng)分析表明AphB能夠直接結(jié)合在toxR的啟動(dòng)子區(qū),并進(jìn)而激活toxR的啟動(dòng)子。而且,AphB能夠通過(guò)對(duì)toxR表達(dá)的影響進(jìn)而調(diào)節(jié)toxT的表達(dá)。我們還分析了AphB對(duì)ToxR調(diào)控的外膜蛋白OmpT和OmpU的作用。這些結(jié)果顯示,霍亂弧菌存在著另外一條調(diào)控回路,即AphB激活兩個(gè)毒力調(diào)控子ToxR和TcpP,ToxR和TcpP一起調(diào)節(jié)主要毒力調(diào)控子ToxT的表達(dá)。 ToxT在致病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用,可以調(diào)控兩種四型菌毛：甘露糖敏感血凝素MSHA和毒素共調(diào)菌毛TCP。MSHA作為一種抗定植因子,它的表達(dá)不利于霍亂弧菌在宿主內(nèi)生存定居。之前的研究認(rèn)為,ToxT需要二聚體的形成才可以發(fā)揮其調(diào)控轉(zhuǎn)錄的作用。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)并證明了ToxT可以通過(guò)結(jié)合在msh操縱子的啟動(dòng)子區(qū),進(jìn)而直接抑制msh操縱子的轉(zhuǎn)錄,并且不需要形成二聚體這一轉(zhuǎn)錄抑制即可發(fā)生,提示,ToxT使用了不同的機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)霍亂弧菌所有組成部分的轉(zhuǎn)錄。 霍亂弧菌是引起霍亂的病原菌,并廣泛存在于水生環(huán)境中。生存環(huán)境的惡劣,可以導(dǎo)致霍亂弧菌進(jìn)入一種特殊的狀態(tài)——活的非可培養(yǎng)(Viable but nonculturable, VBNC)狀態(tài),使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)不能檢出這種特殊狀態(tài)的霍亂弧菌,但其仍具有致病性,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)經(jīng)腸道復(fù)蘇可致病。在本研究中,我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室環(huán)境中成功誘導(dǎo)了霍亂弧菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。在這一過(guò)程中,我們使用平板菌落計(jì)數(shù)描述了可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)的趨勢(shì),以及通過(guò)使用LIVE/DEAD熒光染色方法,觀察了活菌百分比的變化。而且,我們比較了在低溫低營(yíng)養(yǎng)條件下培養(yǎng)了4小時(shí)和24小時(shí)的細(xì)胞與在豐富培養(yǎng)基中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞的整體轉(zhuǎn)錄水平,并描述了在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)超過(guò)300個(gè)基因均發(fā)生了改變,同時(shí)我們選取了一對(duì)toxin-antitoxin基因(VCA0391/2)進(jìn)行研究,觀察其是否能夠幫助霍亂弧菌在惡劣條件下逃避死亡
【圖文】：

霍亂是一種嚴(yán)重的脫水性腹瀉疾病，每年能夠影響到數(shù)以萬(wàn)計(jì)的人。這種重的腸道疾病最顯著的特點(diǎn)是大量的水樣便的出現(xiàn)，人體這種突然的大量失水導(dǎo)致嚴(yán)重的脫水、低血容量性休克、酸中毒，如未即時(shí)醫(yī)治，有可能會(huì)導(dǎo)致器衰竭甚至死亡[I]。自從1817年以來(lái)，七次霍亂的大流行己經(jīng)波及全球[2]，到目為止，我們依然處在第七次大流行當(dāng)中[3]�；魜y弧菌則是導(dǎo)致霍亂疾病發(fā)生的原菌，它是一種革蘭氏陰性菌，一般存在于水體中�；魜y弧菌在進(jìn)入人體經(jīng)過(guò)酸消耗后，剩余的細(xì)菌則能夠進(jìn)入小腸并定植在小腸的上皮細(xì)胞。四型菌毛T的表達(dá)在霍亂弧菌定植小腸的過(guò)程中是必需的[4-6]。一旦霍亂弧菌成功定植在腸，將產(chǎn)生霍亂毒素CT，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的腹瀉的產(chǎn)生。CT和TCP是霍亂弧的兩個(gè)主要的毒力因子，cT是由。翩B編碼的，位于溶源性噬菌體CTx小上TCP由才以“編碼調(diào)控。它們均受到一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的控制，即ToxR調(diào)控單元(如圖l一l所示)。

和酶切鑒定，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pviKnZ衣次尺電轉(zhuǎn)進(jìn)入sM10感受態(tài)細(xì)胞，并與霍亂弧菌lacZ一缺失株的進(jìn)行接合，卡那霉素抗性平板進(jìn)行篩選得到目的菌株r以尺一lacZ。(如圖1一4所示)圖1一4.pvIKllZ一才仍火質(zhì)粒圖譜及同源重組示意圖A.構(gòu)建的質(zhì)粒pVIKllZ寸山成，才山火啟動(dòng)子在lacz上游。B.同源重組示意圖，，才山火啟動(dòng)子位于報(bào)告基因lacZ上游，同時(shí)下游還有一完整的才山火基因。2.4在體外不同條件下，檢測(cè)勿工丑表達(dá)水平。ToxRS蛋白和TcpPH蛋白共同作用，可以激活霍亂弧菌毒力關(guān)鍵因子ToxT的表達(dá)。并且有研究發(fā)現(xiàn)汀印尸仔的表達(dá)受到AP叭和APhB的誘導(dǎo)l‘4，’4]，而toxR則被認(rèn)為是組成性表達(dá)的
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 劉端;細(xì)菌“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”研究進(jìn)展[J];疾病監(jiān)測(cè);1998年09期

2 徐懷恕,R.R.Colwell;霍亂弧菌的越冬方式—活的非可培養(yǎng)狀態(tài)及其檢測(cè)方法[J];青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào);1989年02期

3 許兵，徐懷恕，紀(jì)偉尚;活的非可培養(yǎng)狀態(tài)霍亂弧菌的復(fù)蘇[J];青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào);1994年02期

4 徐懷恕,黃備,祁自忠,王祥紅,紀(jì)偉尚;霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的細(xì)胞形態(tài)研究囿——活的非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)胞[J];青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào);1997年02期

本文編號(hào)：2553376