發(fā)布時(shí)間：2019-10-28 08:23

【摘要】： 血吸蟲病是世界性分布的、危害最為嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病之一。東方田鼠對(duì)血吸蟲具有天然抗性。探索東方田鼠抗日本血吸蟲機(jī)理,篩選東方田鼠抗日本血吸蟲抗性相關(guān)基因或靶基因,對(duì)研制抗日本血吸蟲疫苗和治療藥物具有重要借鑒意義。 本研究首先比較東方田鼠組織器官/裂解物及血清、滅活血清對(duì)體外培養(yǎng)日本血吸蟲童蟲的殺傷效果,然后選用殺傷力較高的肝臟和肺臟裂解物分別親和淘洗篩選日本血吸蟲成蟲(Sj44d)噬菌體展示cDNA文庫(kù),對(duì)獲得的部分陽性克隆進(jìn)行序列測(cè)定、生物信息學(xué)分析、免疫保護(hù)效果評(píng)估、全長(zhǎng)序列的克隆和表達(dá)。 1、將東方田鼠肝臟裂解物、肺臟裂解物、脾臟裂解物、肌肉裂解物、血清和滅活血清分別與日本血吸蟲機(jī)械斷尾童蟲在體外共培養(yǎng),在培22h,童蟲死亡率分別為33.51%、36.33%、3.92%、16.31%、27.06%和29.32%;在培養(yǎng)48h,童蟲死亡率分別為83.07%、69.25%、28.34%、35.91%、86.14%和83.14%。研究結(jié)果顯示,除已有報(bào)道東方田鼠血清對(duì)體外培養(yǎng)血吸蟲具有較高的殺傷作用外,本研究發(fā)現(xiàn)肺臟、肝臟作為血吸蟲移行、發(fā)育的承載器官,其組織裂解物對(duì)血吸蟲也表現(xiàn)顯著的殺傷作用引人注目,對(duì)深入探究東方田鼠抗日本血吸蟲機(jī)理有重要意義。 2、用肝臟裂解物和肺臟裂解物分別篩選日本血吸蟲成蟲(Sj44d)噬菌體展示cDNA文庫(kù),經(jīng)過三輪篩選后,隨機(jī)挑取168個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析,獲得了32條有效展示的EST序列,其中22條EST序列與已知血吸蟲基因或表達(dá)序列標(biāo)簽同源,1條EST序列與其他物種基因同源,為新的血吸蟲表達(dá)序列標(biāo)簽,9條EST序列與已知基因或表達(dá)序列標(biāo)簽均無同源性,為新的表達(dá)序列標(biāo)簽。對(duì)23條具有同源序列知識(shí)背景的EST序列的功能分析結(jié)果顯示,上述EST及其編碼蛋白的功能主要與血吸蟲基因表達(dá)調(diào)控及蛋白質(zhì)加工修飾相關(guān)。研究結(jié)果提示,東方田鼠直接或間接地影響血吸蟲基因表達(dá),使其發(fā)育畸形和延遲,為深入揭示東方田鼠天然抗血吸蟲特性的分子機(jī)理提供重要基礎(chǔ)。 3、將肝臟裂解物篩選獲得的除卵殼蛋白外的所有陽性噬菌體克隆進(jìn)行組合后分別免疫BalB/c鼠,最高獲得了32.90%的減蟲率,33.33%的減雌率,95.49%的糞便減卵率,87.41%的肝臟減卵率。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,各免疫組均產(chǎn)生了較高的抗血吸蟲成蟲可溶性抗原的特異性抗體。結(jié)果表明,本研究篩選獲得的大多EST序列可為挖掘抗日本血吸蟲疫苗候選抗原或藥物靶標(biāo)提供重要資源。 4、根據(jù)篩選獲得的EST序列和生物信息學(xué)分析結(jié)果,以PCR和SMART RACE技術(shù)克隆其中部分基因的全長(zhǎng)ORF序列,共克隆了2條可能的東方田鼠抗性相關(guān)靶基因的全長(zhǎng)ORF序列,其基因功能分別與磷酸二酯酶活性和核糖體結(jié)構(gòu)組成相關(guān)。成功構(gòu)建了一個(gè)全長(zhǎng)ORF序列的重組表達(dá)質(zhì)粒并在大腸桿菌中成功表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物的分子量分別為19.4kD,具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和應(yīng)用潛力。 本論文研究發(fā)現(xiàn)東方田鼠肝臟、肺臟裂解物具有顯著殺傷作用,首次應(yīng)用東方田鼠肝臟和肺臟裂解物篩選東方田鼠抗性相關(guān)的血吸蟲靶基因,獲得一批具有深入研究?jī)r(jià)值的靶分子、EST序列及全長(zhǎng)cDNA,對(duì)探索東方田鼠抗日本血吸蟲的分子機(jī)理、開拓抗血吸蟲疫苗和藥物研究新途徑具有重要意義。
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碩士學(xué)位論文 第三章 日本血吸蟲抗性相關(guān)靶基圖 1 東方田鼠肝臟提裂解物篩選 Sj44d 噬菌體展示 cDNA 文庫(kù)第一輪 PCR 鑒定結(jié)果 The first turn PCR rssult of screening Sj44d phage display cDNA library by liver extraction o1-16 隨機(jī)挑取的噬菌體克隆 PCR 產(chǎn)物1-16 PCR product of the randomly picked phage clones

噬菌體富集了近百倍，PCR 鑒定（圖 1、2）顯示，隨著篩選 2 東方田鼠肝臟裂解物篩選 Sj44d 噬菌體展示 cDNA 文庫(kù)第三輪 PCR 鑒定結(jié)ird turn PCR result of screening Sj44d phage display cDNA libray by liver extraction1-14 隨機(jī)挑取的噬菌體克隆 PCR 產(chǎn)物1-14 PCR product of the randomly picked phage clones圖 1 東方田鼠肝臟提裂解物篩選 Sj44d 噬菌體展示 cDNA 文庫(kù)第一輪 PCR 鑒he first turn PCR rssult of screening Sj44d phage display cDNA library by liver extra1-16 隨機(jī)挑取的噬菌體克隆 PCR 產(chǎn)物1-16 PCR product of the randomly picked phage clones
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

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5 王s，

本文編號(hào)：2553020