【摘要】： 赭曲霉毒素A (ochratoxin A, OA)是一種有毒性的真菌次級代謝產(chǎn)物,主要由某些曲霉和青霉產(chǎn)生,可污染糧食、蔬菜及咖啡、葡萄、可可等經(jīng)濟(jì)作物,由于可污染物種很多,且產(chǎn)毒菌株可適應(yīng)的環(huán)境廣泛,因此已造成了全球的廣泛傳播。它具有較強(qiáng)的腎毒性和肝毒性,并具有致畸性、致癌性、免疫毒性和胚胎毒性,很多國家都設(shè)立了限量標(biāo)準(zhǔn),因此建立成本低且快速有效的現(xiàn)場檢測方法極為重要。免疫學(xué)方法由于其快速、高靈敏度、高特異性、成本低以及攜帶操作方便等優(yōu)點(diǎn)已得到廣泛的青睞。 本實(shí)驗(yàn)采用活性酯法將OA與載體蛋白偶聯(lián)制得人工抗原,經(jīng)過紫外、紅外、熒光光譜以及圓二色譜對其進(jìn)行了比較全面的鑒定分析,并通過熒光猝滅進(jìn)一步探討了OA與載體蛋白的反應(yīng)機(jī)制,隨后免疫BALB/c小鼠,研究了抗血清的各項(xiàng)特性,并進(jìn)行了加標(biāo)回收和實(shí)際樣品檢測,建立了間接競爭ELISA。 1赭曲霉毒素A人工抗原的構(gòu)建 OA是小分子物質(zhì),分子量僅為403.8,因此屬于只有反應(yīng)原性而無免疫原性的半抗原,只有通過與載體蛋白偶聯(lián)構(gòu)建成人工抗原后才能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。本研究利用OA結(jié)構(gòu)中的羧基,采用活性酯法將OA與牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)和卵清蛋白(ovalbumin, OVA)偶聯(lián),制備免疫抗原OA-BSA和包被抗原OA-OVA。 通過紫外、紅外、熒光光譜以及圓二色譜法對人工抗原進(jìn)行分析,在紫外光譜中,載體蛋白與OA的結(jié)合導(dǎo)致OA酚羥基pKa降低,以致吸收峰紅移至380nm處,OA與BSA和OVA的偶聯(lián)摩爾比分別達(dá)到11：1和7.6：1,OA的利用率分別為50.5%和38.6%。；在紅外光譜中,較載體蛋白而言,人工抗原在1545cm-1處的伯胺基吸收峰明顯降低,且OA內(nèi)酯環(huán)在載體蛋白的作用下于1589cm-1處出現(xiàn)一個小而尖銳的峰；在熒光光譜中,OA對人工抗原中載體蛋白在340nm處的特征峰產(chǎn)生強(qiáng)烈的猝滅作用,并通過同步熒光進(jìn)一步分析,OA對酪氨酸殘基和色氨酸殘基皆有猝滅作用,且人工抗原中兩種殘基的熒光峰位都有小幅度的藍(lán)移,說明偶聯(lián)后其極性降低,疏水性增強(qiáng)。以上結(jié)果均表明,OA與載體蛋白成功的通過活性酯法發(fā)生了偶聯(lián)。另外,通過不同濃度OA與BSA的混合液的熒光光譜分析,對OA與BSA的偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步探討,我們發(fā)現(xiàn)隨著OA濃度的提高,OA對BSA的猝滅作用逐漸加強(qiáng),但趨勢漸緩,且遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到活性酯法制備的免疫原OA-BSA的猝滅程度,而在同步熒光中也證明,混合液中OA只對亮氨酸殘基產(chǎn)生了熒光猝滅,這都證明了活性酯法的有效性。人工抗原的圓二色譜中,正峰和負(fù)峰強(qiáng)度都明顯降低,經(jīng)過CDSSTR軟件分析得知蛋白的α-螺旋含量降低,而β-折疊含量升高,說明其結(jié)構(gòu)更為伸展,更有利于OA暴露于蛋白表面；而混合液中,隨著OA濃度的增大,負(fù)峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),經(jīng)過CDSSTR軟件分析得知,蛋白的α-螺旋含量升高,而β-折疊含量降低,這意味著肽鏈?zhǔn)湛s,蛋白的疏水性增強(qiáng)。人工抗原的熒光光譜和圓二色譜與混合液的顯著差別,充分證明人工抗原制備成功。 2抗OA抗血清的制備及其性質(zhì)研究 以O(shè)A-BSA免疫三組BALB/c小鼠,每組三只,免疫抗原劑量皆設(shè)定為80μgOA-BSA/次／只,第一組免疫周期為21d,第二組免疫周期為14d,第三組免疫周期為7d。通過抗體生成曲線我們看出,三組小鼠均對OA-BSA產(chǎn)生了免疫應(yīng)答,第一組和第二組在第三次免疫后抗體產(chǎn)生顯著,第四次免疫后抗體產(chǎn)生開始趨于平緩,而第三組在第六次免疫后抗體才明顯產(chǎn)生,而第七次免疫后抗體產(chǎn)生開始趨于穩(wěn)定。對第一組小鼠第三次免疫后、第二組小鼠第四次免疫后以及第三組小鼠第七次免疫后的抗血清進(jìn)行性質(zhì)分析,其效價均在105左右。通過方陣實(shí)驗(yàn)測得其抗原抗體最佳反應(yīng)濃度后,采用間接競爭ELISA的方法測定三組小鼠抗血清的靈敏度,發(fā)現(xiàn)第一組小鼠確定為第一組小鼠靈敏度在5-7ng/mL,線性范圍在1-10ng/mL,第二組小鼠靈敏度在13-15ng/mL,線性范圍在1-100ng/mL,第三組小鼠靈敏度在28-37ng/mL,線性范圍在1-100 ng/mL。對小鼠抗血清進(jìn)行特異性分析,結(jié)果顯示該抗血清特異性較好,與參試的黃曲霉毒素B1、桔霉素、玉米赤霉烯酮均無交叉反應(yīng)。 3赭曲霉毒素A的加標(biāo)回收和實(shí)際樣品檢測 通過icELISA制得了OA抗血清檢測OA的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性方程為y=-0.1397x+1.9539,R2=0.9937。經(jīng)ELISA分析,確定OA的平均添加回收率為71.5%-88.2%,變異系數(shù)為0.137%-20.56%。在此基礎(chǔ)上,將從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)附近市場購買的若干大米和玉米樣品和湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈的樣品進(jìn)行實(shí)際樣品檢測,部分樣品中有可檢出OA。
【圖文】：

OA一BSA1.撫rm司五.t亡2(un勝.bl晚)圖2一 1oA一BsA的合成途徑示意圖FigZ一 1ThesehematieillustrationofOA一 BSAsynthes九 ePathway3.2紫外一可見光譜分析OA、BSA、O、叭以及人工抗原OA一BSA、OA一O、叭進(jìn)行UV一Vis吸收光譜分析，結(jié)果如圖2一2、2一3所示。1，5‘一，卜一-問.一一刁卜-330日S八《，mglmL)OA《0.135nlglmL)OA.BSA(lmglmL)00匕月q‘O的q哎0.0一25040�！瓐D2一 2BSA、oA和oA一BsA的uv-vis光吸收圖譜Fig.2一 2UV-VissPeetrogramofBSA， OAandOA一BSA

0.0十250圖2一 3OvA、oA和oA一ovA的uv-vis光吸收圖譜FigZ一 3UV-VissPeetrogramofOVA， OAandOA一0、/A由圖2一2和圖2一3可知，偶聯(lián)反應(yīng)之前OA的最大紫外吸收峰在 330nm處，BSA與ovA最大紫外吸收峰在278nln處，而人工抗原OA一BSA與OA一ovA在380nln處有最大紫外吸收峰，這是由于OA在與載體蛋白結(jié)合后，在載體蛋白的作用下，其酚輕基pKa大大降低，以致吸收峰發(fā)生了紅移 (Chuetal.
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王瑩;同時檢測多種真菌毒素的生物芯片技術(shù)研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

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本文編號：2553045