發(fā)布時(shí)間：2019-10-18 07:05

【摘要】： DNA疫苗安全可靠,可以同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫,是具有廣闊應(yīng)用前景的新型疫苗。但目前多數(shù)處于臨床試驗(yàn)階段的DNA疫苗尚存在諸多缺陷,最主要的問題是免疫原性較差。如何有效提高DNA疫苗的免疫原性是DNA疫苗研究領(lǐng)域亟待解決的問題。本課題對DNA疫苗優(yōu)化設(shè)計(jì)與DNA疫苗導(dǎo)入技術(shù)兩個(gè)方面進(jìn)行了探索。 在疫苗構(gòu)建方面,對本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的DNA疫苗載體pDRVISV1.0進(jìn)行優(yōu)化,刪除非必要序列,構(gòu)建了DNA疫苗載體pDRV14.0,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了帶有HIV-1Env、Gag、Pol和TNR基因的DNA疫苗質(zhì)粒p4.0Env、p4.0Gag、p4.0Pol和p4.0TNR,使用DNA疫苗p1.0Env和p4.0Env免疫小鼠,運(yùn)用ELISPOT法檢測兩種疫苗的免疫原性,結(jié)果顯示刪除非必需序列對DNA疫苗免疫原性無明顯影響。在pDRVI4.0載體基礎(chǔ)上,本課題構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)兩種抗原基因的雙順反子DNA疫苗p4.0AEnvTNR和p4.0AGagPol。在小鼠模型,我們對比了雙順反子DNA疫苗與兩個(gè)單順反子疫苗質(zhì)�；旌厦庖咚T導(dǎo)的免疫反應(yīng),對比了兩種雙順反子DNA疫苗混合免疫混合免疫與四種單順反子DNA疫苗質(zhì)粒混合免疫的免疫原性。結(jié)果顯示,雙順反子DNA疫苗的免疫原性與單順反子DNA疫苗混合免疫無顯著性差異。此外,還構(gòu)建了啟動子方向相同和相反的雙順反子DNA疫苗p4.0SEnvPol、p4.0SGagTNR、p4.0AEnvPol和p4.0AGagTNR,并在小鼠模型中進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)啟動子的方向?qū)NA疫苗的免疫原性無顯著性影響。 在DNA導(dǎo)入技術(shù)方面,本首先對基因槍導(dǎo)入?yún)?shù)進(jìn)行了優(yōu)化,包括劑量和次數(shù)。結(jié)果表明,HIV-1 p1.0Env DNA疫苗基因槍免疫的最優(yōu)劑量為2.25μg,最佳免疫次數(shù)為3次。在此基礎(chǔ)上,我們對基因槍免疫和電穿孔導(dǎo)入技術(shù)對報(bào)告基因表達(dá)和DNA疫苗免疫原性的增強(qiáng)效果進(jìn)行了對比。本課題構(gòu)建了帶有螢火蟲熒光素酶基因的DNA疫苗質(zhì)粒pDRVISV1.0Luciferase作為報(bào)告質(zhì)粒注射小鼠,利用可見光體內(nèi)活體成像技術(shù)檢測螢光素酶報(bào)告基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá),結(jié)果表明基因槍轟擊1μg劑量的報(bào)告質(zhì)粒產(chǎn)生的基因表達(dá)水平10倍于肌肉注射50μg質(zhì)粒所產(chǎn)生的表達(dá)。使用電穿孔導(dǎo)入技術(shù)可獲得比同劑量質(zhì)粒肌肉注射高近5倍的報(bào)告基因表達(dá)。相應(yīng)的,在誘導(dǎo)抗體反應(yīng)方面,基因槍免疫也比電穿孔投送更有優(yōu)勢。但是,基因槍免疫誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)類型非常偏向Th2型,其抗原特異性T細(xì)胞免疫的能力很弱。而基因槍免疫則均衡而顯著地增強(qiáng)了抗原特異性T細(xì)胞和抗體免疫反應(yīng)。對于HIV DNA疫苗來說,體內(nèi)電穿孔技術(shù)是較理想的質(zhì)粒DNA投送技術(shù)。 經(jīng)本課題的綜合優(yōu)化,新一代HIV DNA疫苗的免疫原性得到了大幅度的提高,為下一步臨床前研究和臨床試驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖1:吹氮干燥儀示意圖 TubmgPrePStation3)子彈的干燥與切割:吹氮干燥儀各結(jié)構(gòu)如圖1所示;a)連接吹氮干燥儀的電源和導(dǎo)氣管，壓迫彈性機(jī)構(gòu)①，取下轉(zhuǎn)導(dǎo)管②，打開氮?dú)怃撈康拈y門，調(diào)節(jié)減壓閥，使輸出壓力為ZMPa，打開減壓閥⑦精調(diào)壓力，觀察壓力表⑥，使示數(shù)為0.2MPa;b)將子彈管的一頭插入密封套⑩，另一頭插入另一端孔中，流量計(jì)⑤開關(guān)到0.3一O.4L/min，空吹10一15min;c)將子彈管的出口端依次套上連接用管和10ml注射器，，將子彈管的另一端從密封圈拔出

在的增強(qiáng)子作用，在多克隆位點(diǎn)下游即目的基因的3’端帶有牛生長激素PofyA加尾信號，該信號可以增加轉(zhuǎn)錄后的mRNA的穩(wěn)定性使目的基因的表達(dá)效率。DNA疫苗構(gòu)建流程如圖2和圖3所示。具體構(gòu)建方法如下:l)單順反子DNA疫苗的構(gòu)建以pD又叮SVI.o為模板，運(yùn)用PCR并結(jié)合克隆的方法(所用PCR引物、各工具酶反應(yīng)條件詳見表2、表7，)，擴(kuò)增復(fù)制子CofEI和卡那霉素抗性基因Kan，使用限制性內(nèi)切酶Bgln和BsrGI雙酶切(酶切位點(diǎn)通過引物5’端引入)，連接轉(zhuǎn)化后得到質(zhì)粒pBasic;以PDRVISVI.Ose為模板，運(yùn)用PCR的方法擴(kuò)增表達(dá)盒，以ExpFI和ExpRI為引物的擴(kuò)增產(chǎn)物和pBasie用Ec0RI和Kvnl雙酶切
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 郝彥玲;張夢華;黃云堅(jiān);袁國亮;陳佩;朱旭輝;傅晶晶;劉勇;邵一鳴;;HIV-1 GP120主要抗原性片段的制備及其在HIV診斷中的應(yīng)用[J];中國生物制品學(xué)雜志;2006年01期

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3 李鼎鋒;張玉偉;李海山;范文玲;孫茂盛;劉勇;邵一鳴;;體內(nèi)電穿孔對報(bào)告基因表達(dá)和HIV Gag DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的影響[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2006年11期

本文編號：2550971