【摘要】：分枝桿菌尤其是結(jié)核分枝桿菌是引起人類患結(jié)核病的主要病原微生物,目前結(jié)核病仍然是我國(guó)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。本文旨在通過(guò)對(duì)結(jié)核分枝桿菌(北京譜系)的群體遺傳關(guān)系及膿腫分枝桿菌中硝基還原酶基因的克隆表達(dá)相關(guān)研究,希望能夠?yàn)榻Y(jié)核病防控策略的制定及快速準(zhǔn)確的鑒定分枝桿菌提供參考依據(jù)。 本文首先采用24位點(diǎn)VNTR基因分型技術(shù)對(duì)我國(guó)北方五省(黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古和寧夏)的234株結(jié)核分枝桿菌(北京譜系)進(jìn)行了分型鑒定,各VNTR位點(diǎn)的等位基因多態(tài)性(h)普遍較低(h值范圍：0.000-0.744)；個(gè)體水平系統(tǒng)發(fā)育分析顯示各菌株分散存在于N-J樹的各個(gè)進(jìn)化分枝,最小生成樹中約62.0%(145/234)的菌株被劃分到同一“克隆復(fù)合群”;群體水平系統(tǒng)發(fā)育樹顯示234株菌與MIRU-VNTRplus數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.miru-vntrplus.org)中的結(jié)核分枝桿菌(北京譜系)的遺傳關(guān)系最近(Bootstrap值為100)；通過(guò)貝葉斯模型計(jì)算了最近共祖年代約為5308年(95%CIs：4263年-6470年)；分子方差分析結(jié)果表明吉林與黑龍江、遼寧兩省菌株之間,內(nèi)蒙古與寧夏菌株之間遺傳分化系數(shù)不存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 采用生物信息學(xué)方法對(duì)膿腫分枝桿菌中被注釋為" putative nitroreductase "的基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析,結(jié)果顯示該基因編碼219個(gè)氨基酸；對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)(不穩(wěn)定系數(shù)為54.52,總平均親水性為-0.244)；理論分子量和等電點(diǎn)分別為24.38KDa和6.52；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲為主要構(gòu)件；氨基酸序列與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中3gr3蛋白A鏈的相似性最高為60%,空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明該蛋白是硝基還原酶家族成員之一,可能具有還原對(duì)硝基苯甲酸的功能。 利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)"putative nitroreductase"基因進(jìn)行了體外表達(dá),目的蛋白以包涵體形式存在；采用親和層析方法對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行了純化,并通過(guò)透析復(fù)性處理,得到了可溶性的目的蛋白；灰度掃描分析結(jié)果顯示其純度為89.6%; Western blot結(jié)果顯示在約30KDa處得到了顯色帶,且特異性較好；BCA蛋白定量法測(cè)得其濃度為0.59μg/μL;酶的比活力為32.2U/mg。 應(yīng)用Plackett-Burman設(shè)計(jì)考察了影響目的蛋白表達(dá)量的胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、IPTG、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、卡那霉素濃度和pH值8個(gè)因素,從中篩選出了IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間三個(gè)主要影響因素；通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域并找出了響應(yīng)面優(yōu)化的中心點(diǎn)；運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法確定了重要因素的最佳水平,即IPTG濃度：0.67mM、誘導(dǎo)溫度：40℃、誘導(dǎo)時(shí)間：6.8h,Y的最大估計(jì)值為59.4%。對(duì)模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近優(yōu)化預(yù)測(cè)值。
【學(xué)位授予單位】：河南工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378.911

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2546688