【摘要】： 目的 1.建立間接包被ELISA (enzyme linked immunosorbent assy,酶聯(lián)免疫吸附試驗)檢測血清游離β-HCG (free-β-huaman chorionic gonadotropin,F-β-HCG)檢測方法。 2.探討降低ELISA試驗中非特異反應的方法。 3.評估游離β-HCG檢測在相關(guān)疾病診療中的意義。 方法 1.間接包被ELISA法檢測血清游離β-HCG方法學建立(1)BBC酶標反應板的制備,(2)抗游離β-HCG單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb)的生物素化, (3)辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)過碘酸鈉法標記抗游離β-HCG多克隆抗體(polyclonal antibody, pAb),(4)間接包被ELISA法檢測血清游離β-HCG方法學建立及評價。 2.降低ELISA中非特異顯色方法學探討(1)更換標準品稀釋液,(2)用連接有包被抗體的親和層析柱提純酶標抗體,(3)在酶標抗體中加入包被抗體的Fc段3.血清游離β-HCG與相關(guān)疾病的臨床研究(1)血清游離β-HCG檢測對正常妊娠與異位妊娠的診斷意義,(2)血清游離β-HCG檢測在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中的臨床意義。 結(jié)果 1.間接包被ELISA法檢測血清游離β-HCG方法學建立：通過對該方法中各種反應條件的優(yōu)化,確定了最適工作條件：生物素抗體和酶標抗體的最適工作濃度分別為1：1000和1：12000,本檢測方法具有較好的穩(wěn)定性,靈敏度0.1ng/ml,回收率95.92%～102.51%,批內(nèi)差異7.54%～11.12%,批間差異12.51%～18.11%,與FSH、TSH、LH、α-HCG的交叉反應率0.1%,檢測范圍0.1～500ng/ml,與進口試劑盒的相關(guān)性尚可(r2=0.7892)。 2.降低ELISA中非特異顯色方法學探討：結(jié)果顯示,更換標準品稀釋液和用連接有包被抗體的親和層析柱提純酶標抗體兩種方式對本方法不適用,而向酶標抗體中加入包被抗體的Fc段在本實驗中效果顯著。 3.血清游離β-HCG與相關(guān)疾病的臨床研究：正常妊娠孕婦血清游離β-HCG水平明顯高于異位妊娠患者(p0.05),妊娠滋養(yǎng)細胞疾病患者血清游離β-HCG水平明顯高于正常妊娠孕婦(p0.05)。 結(jié)論 1.本文研制的間接包被檢測血清游離β-HCG方法,引入了生物素-親合素系統(tǒng),提高了抗體利用率,在很大程度上降低了“鉤狀效應”的產(chǎn)生,且靈敏度高、特異性好,具有較好的穩(wěn)定性和檢測范圍,適于臨床應用。 2.本文探討了三種降低ELISA中非特異顯色的方法,均具有一定的應用價值,尤其在酶標抗體中加入包被抗體的Fc段的方法,目前國內(nèi)尚無相關(guān)報道,有待進一步研究。 3.血清游離β-HCG的測定為異位妊娠、妊娠滋養(yǎng)細胞疾病等的診斷提供重要依據(jù)。
【圖文】：

ProtainA純化抗F一p一HCGmab

1.1.2.3酶標抗體的標記1.1.2.3.1實驗原理:經(jīng)典的過碘酸鈉(NaIO4)法，需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的a和。氨基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來wilson等改用在低pH下使用NaIO4活化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP的步驟。HRP經(jīng)NalO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進一步用NaBH‘(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標一記抗體。酶與抗體結(jié)合后，根據(jù)分子篩原理，可用SePhadexGZoo凝膠將酶結(jié)合物與游離的酶及抗體分開。1.1.2.3.2實驗方法(l)HRp的活化:稱取20mg的HRP，溶于1omM(pH7.4)的醋酸鈉溶液中，終濃度為Zomg/ml。在酶中加入17oulo.ZM的Nalo4，邊加邊攪拌，室溫避光反應15min。再加入0.sml乙二醇，室溫避光攪拌smin，以終止反應。(2)HRp的脫鹽:將SephadexG25凝膠預處理后裝柱。用10倍體積0.3M的pHg.5碳酸鹽緩沖液平衡柱體。將處理過的HRP上樣，收集洗脫液顏色最深的部分(圖2)，，此過程主要目的為脫鹽。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392.7

【參考文獻】

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