【摘要】： 研究背景：組織工程血管以及組織工程化組織的血管化因目前內(nèi)皮種子細(xì)胞擴(kuò)增能力和生物活力的不足而受到限制。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。并可被轉(zhuǎn)移至外周血,參與缺血組織的血管重建和血管的內(nèi)膜化,因此EPCs有望成為今后組織工程內(nèi)皮種子細(xì)胞的重要來(lái)源。為此,有關(guān)EPCs的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)、擴(kuò)增和細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控亟待深入研究,在細(xì)胞行為調(diào)控中,鈣離子是細(xì)胞生物行為的重要調(diào)控因子,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡時(shí),會(huì)導(dǎo)致多種細(xì)胞異常行為發(fā)生,從而引發(fā)疾病。鈣離子載體A23187是一種高度選擇性的鈣離子載體,能與Ca2+形成穩(wěn)定的復(fù)合物,使胞外的Ca2+透過細(xì)胞膜,生理性或人為性地提高胞漿游離鈣水平,有效增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,增高的Ca2+作為第二信使可促使蛋白激酶C(PKC)和其他鈣依賴性蛋白激酶活化,并催化細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)磷酸化,從而啟動(dòng)淋巴細(xì)胞活化、增殖。此外,A23187還是氧化磷酸化的解偶聯(lián)體,抑制線粒體ATP酶的活性,影響細(xì)胞代謝水平。 研究目的第一部分研究目的在于建立體外培養(yǎng)臍血來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)體系,包括臍帶血采集、單個(gè)核細(xì)胞分離、內(nèi)皮祖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)、內(nèi)皮祖細(xì)胞生長(zhǎng)特性和表型分析鑒定。第二部分研究目的在于利用移動(dòng)性鈣離子載體A23187作用于內(nèi)皮祖細(xì)胞,觀察其對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的作用影響；以表面增強(qiáng)激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(surfaceenhanced laser desorption／ionization-time of flight-mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)技術(shù)分析A23187作用后的內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化及其對(duì)細(xì)胞表型和細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響,探討不同濃度A23187及引起的相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制和作用,為內(nèi)皮祖細(xì)胞調(diào)控機(jī)制和臨床應(yīng)用提供研究依據(jù)。 研究方法在第一部分中,經(jīng)無(wú)菌采集后的臍帶血,在2小時(shí)內(nèi)經(jīng)密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞,以本室已建立的內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)體系培養(yǎng),從臍血獲得的單個(gè)核細(xì)胞接種4天后,分別選取貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)至第12天后,觀察兩種方法所獲得細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量。對(duì)懸浮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)培養(yǎng)7天后的細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)皮祖細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞表型CD34、CD133、vWF、CD146,CD144鑒定,培養(yǎng)過程中,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況并測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。在第二部分中,鈣離子載體A23187以0,1,3,5μmol／L作用于培養(yǎng)至第七天的內(nèi)皮祖細(xì)胞,作用24小時(shí),后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A23187不同濃度作用下細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化,并且利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度A23187作用下P1H12 (CD146)的表達(dá)量。采用SELDI蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)不同A23187濃度作用下蛋白質(zhì)差異表達(dá)情況：1.Western-IP裂解液進(jìn)行蛋白質(zhì)提取并利用BCA法測(cè)定蛋白濃度；2.蛋白活化點(diǎn)樣；3.芯片檢測(cè)；4.數(shù)據(jù)處理與分析。 研究結(jié)果第一部分中,經(jīng)觀察篩選,發(fā)現(xiàn)從臍血獲得的單個(gè)核細(xì)胞接種4天后,分別選取貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)至第12天后,觀察兩種方法所獲得細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量。發(fā)現(xiàn)選取貼壁細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞總數(shù)較少為301±205,并且無(wú)梭形樣內(nèi)皮祖細(xì)胞出現(xiàn)；相反,選取懸浮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),至第12天時(shí),細(xì)胞數(shù)量達(dá)708±142(P0.05),并且出現(xiàn)梭形樣內(nèi)皮祖細(xì)胞。故此,本研究選用懸浮細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),其接種后前5天為生長(zhǎng)的潛伏期,細(xì)胞開始貼壁,無(wú)明顯擴(kuò)增。第6天平均每個(gè)視野下細(xì)胞數(shù)目為287±45；第9天細(xì)胞數(shù)為282±46；第12天開始,細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞數(shù)為805±67(P0.05,與第6天的細(xì)胞相比)；第19天細(xì)胞繼續(xù)增殖,細(xì)胞數(shù)為1115±182(P0.05,與第6天的細(xì)胞相比)；第23天時(shí),細(xì)胞進(jìn)入凋亡期,數(shù)量明顯減少,為265±61(P0.05,與第6天的細(xì)胞相比)。vWF,CD146,CD144表達(dá)陽(yáng)性。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,梭形樣細(xì)胞群體中,CD34陽(yáng)性率為88.98%±5.15%(P0.05),CD133陽(yáng)性率為1.20%±1.44%(P0.05)。第二部分中,經(jīng)SELDI技術(shù)檢測(cè)A23187不同濃度組,結(jié)果顯示共有20個(gè)差異表達(dá)蛋白,其中12個(gè)高表達(dá),8個(gè)為低表達(dá)(P0.05)。并且內(nèi)皮祖細(xì)胞CD146陽(yáng)性率呈A23187濃度依賴性降低,并發(fā)現(xiàn)鈣離子載體A23187在濃度高至10μmol／L時(shí),有顯著促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡作用。 研究結(jié)論經(jīng)本研究建立的內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)體系,能夠自臍帶血來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出具內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài)特征的細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞表型鑒定為內(nèi)皮祖細(xì)胞。對(duì)上述內(nèi)皮祖細(xì)胞以鈣離子載體A23187作用,發(fā)現(xiàn)A23187在低濃度時(shí),抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化；高濃度時(shí),凋亡細(xì)胞數(shù)目增加,有濃度依賴性促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡,并且具有抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用。 待研究工作：對(duì)本研究中以SELDI技術(shù)檢出的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步分析,采用二維凝膠電泳及質(zhì)譜法對(duì)于差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定。
【圖文】：

圖2臍帶血單個(gè)核細(xì)胞所獲得的內(nèi)皮祖細(xì)胞(IOX20)Fig.2EPCsfromumbiliealeordbloodmononucleareellsNote:AEPCseoloniesappearedatdays;BTherearethreedifferenimorphtyPesofcellsatday6:CThenumberofeobblestone一likeeellsincreasedatDNoeellapoPtosisbefoundatday19;EThenurnberofeellsbeeamede(10X20).2.3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定人臍血源性內(nèi)皮祖細(xì)胞原代培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線顯示，細(xì)胞在接種后前5天為細(xì)胞逐漸開始貼壁，無(wú)明顯擴(kuò)增;12天以后，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)活躍;培養(yǎng)至第19天時(shí)，細(xì)胞數(shù)目最多;到23天后，進(jìn)入衰退期，細(xì)胞開數(shù)目減少，如表2。表2細(xì)胞生長(zhǎng)情況Tab1e2GrowingstatesofEPCs(對(duì)‘，，n=3)

B圖2.A23187不同濃度干預(yù)下，CD146細(xì)胞陽(yáng)性率A.不同濃度A23187作用下細(xì)胞散點(diǎn)圖;B.不同濃度A23187作用下CD146細(xì)胞陽(yáng)性率2.3SELDI檢測(cè)不同濃度A23187干預(yù)下EPc蛋白表達(dá)的變化2.3.1四組均檢測(cè)出較多的蛋白質(zhì)峰各組樣本蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)用BiomarkerWizard軟件對(duì)所有蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，以減少不同芯片、儀器狀態(tài)波動(dòng)等因素引起的實(shí)驗(yàn)誤差。每例樣本在質(zhì)荷比2.0一300kD均能檢測(cè)出222個(gè)蛋白峰。2.3.2各組間蛋白差異表達(dá)明顯的峰與對(duì)照組相比，1，3，5uMA23187作用的EPCS檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)共有20個(gè)蛋白差異表達(dá)明顯的峰。其中，高表達(dá)的有12個(gè)，低表達(dá)的有8個(gè)(表2)，(P<0.05)。表2WCxZ蛋白芯片篩選到A23187干預(yù)組與對(duì)照組的差異蛋白(P<0.05)表達(dá)量降低的蛋白質(zhì)荷比(m/z)表達(dá)量增高的蛋白質(zhì)荷比(m/z)les甲les寧lee甲..1甲
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2545966