【摘要】： 自身免疫性疾病是因機體免疫系統(tǒng)對自身成分發(fā)生免疫應(yīng)答而導(dǎo)致的疾病,在人群中有較高的發(fā)病率。炎性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn's disease,CD),主要是由機體對原本處于耐受的正常菌群發(fā)生異常的免疫應(yīng)答所致的非特異性炎性腸疾病。在西方國家發(fā)病率為10萬分之4-6。在我國,由于近年國人飲食結(jié)構(gòu)的改變,其發(fā)病率有逐年上升的趨勢,根據(jù)國內(nèi)文獻報道,近5年的病例數(shù)是上世紀(jì)90年代同期的8倍。該病主要癥狀表現(xiàn)為腹瀉、黏液膿血便和腹痛,病久可發(fā)生癌變,嚴(yán)重威脅著國人的身體健康。而針對IBD,臨床上主要以對癥治療為主,尚沒有一種行之有效的治療手段,因此迫切需要探索一種從根本上治療的方法。 Transforming Growth Factor-beta1(TGF-beta1)是一種含有112個氨氨基酸,分子量25KD的二聚體蛋白質(zhì)。在各種屬間高度保守,例如人和大鼠、小鼠有完全相同的氨基酸序列。幾乎所有細胞都有TGF-beta1的受體,其對細胞的生長、分化的影響是非常廣泛的。對T細胞,TGF-beta1可以抑制其增殖,抑制Th1和Th2細胞的分化,抑制CTL的分化,誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的產(chǎn)生;對B細胞,TGF-beta1可以抑制B細胞的增殖,誘導(dǎo)IgA的類別轉(zhuǎn)換,還可以誘導(dǎo)不成熟和靜息B細胞的凋亡。對NK細胞,TGF-beta1可以抑制NK細胞分泌IFN-γ及其溶細胞的功能;對樹突狀細胞(DC)TGF-beta1抑制DC的成熟及其抗原遞呈功能;TGF-beta1還可以抑制活化的巨噬細胞(MΦs),肥大細胞及粒細胞的功能。 目前認為DC是功能最強大的抗原遞呈細胞(APC),不同來源及不同成熟狀態(tài)的DC能夠正向或負向調(diào)節(jié)T細胞的免疫功能。DC有許多亞群,包括髓樣DC、漿細胞樣DC和朗格罕斯細胞,分別在對免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不同的作用。除了免疫活化的能力之外,不同亞群的DC在某種生理狀態(tài)下或某種外來條件的干預(yù)下可以發(fā)揮免疫抑制功能,誘導(dǎo)中樞及外周免疫耐受。如IL-4或Fas L基因修飾的DC可以抑制小鼠的遲發(fā)性超敏反應(yīng)(delayed-type hypersensitivity,DTH)及膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)。 Exosomes是各種活細胞分泌的,非質(zhì)膜來源的,直徑介于50-100nm的具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的小囊泡。在體內(nèi),exosomes對免疫系統(tǒng)發(fā)揮著雙向調(diào)節(jié)的作用。腫瘤細胞來源的exosomes攜帶有腫瘤抗原,能夠?qū)⒛[瘤抗原遞呈到DC,活化其抗腫瘤免疫,消除已經(jīng)建立的小鼠腫瘤。APC來源的exosomes表達MHC-I、MHC-Ⅱ和T細胞共刺激分子,提示其具有免疫調(diào)節(jié)功能�；蛐揎棻磉_vIL-10、Fas L或IL-4的骨髓DC來源的exosomes能夠抑制小鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)及膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎,過繼實驗表明基因修飾的exosmes可以在體內(nèi)調(diào)節(jié)APC的功能并誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生,從而發(fā)揮系統(tǒng)性的免疫抑制功能。 骨髓來源未成熟DC(imDC)由于其分化不成熟,MHC及各種輔助分子表達較低,因此imDC來源的exosomes可以抑制免疫細胞的活化,誘導(dǎo)機體免疫耐受的產(chǎn)生。基因修飾表達TGF-beta1的imDC能夠發(fā)揮系統(tǒng)性的免疫抑制功能,促進同種異體小鼠移植心臟的長期存活。Treg在腸道的免疫平衡中發(fā)揮著重要的作用,而TGF-beta1可以誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生。當(dāng)在腸道TGF-beta1信號的缺失的情況下,小鼠表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的IBD進展,因此TGF-beta1的信號對腸道的免疫自穩(wěn)狀態(tài)的維持將發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本課題將利用葡聚糖硫酸鈉鹽(DSS)建立IBD小鼠自身免疫病動物模型,利用TGF-beta1基因修飾的骨髓imDC來源的exosomes(TGF-beta1-exo)腹腔注射模型小鼠,評價TGF-beta1-exo在IBD進展過程中的保護性效果,從而探討TGF-beta1-exo是否能發(fā)揮系統(tǒng)性的免疫抑制功能,恢復(fù)腸道的免疫平衡。 第一部分 TGF-beta1基因修飾的骨髓未成熟樹突狀細胞來源的exosomes的制備鑒定及其體外功能 采用單獨的rmGM-CSF骨髓細胞體外培養(yǎng)方法,可以獲得具有穩(wěn)定的不成熟表型的DC,而且純度也較為理想,平均在60-70%左右。流式細胞術(shù)(FACS)鑒定培養(yǎng)7天的細胞,其表面表達小鼠DC的標(biāo)志物CD11c,低表達MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子CD40、CD86。 為了能最高限度的提高AdTGF-beta1對大量DCs的轉(zhuǎn)染效率,我們先用CsCl密度梯度離心將腺病毒進行純化,然后依據(jù)相關(guān)文獻以重復(fù)轉(zhuǎn)染率(MOI)等于50進行病毒轉(zhuǎn)染,在2h的無血清轉(zhuǎn)染過程中,我們將DCs與病毒混合液置于37℃搖床上保持不停震搖,使腺病毒與DCs充分接觸,大大提高了轉(zhuǎn)染效率。在高效轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上,我們對經(jīng)過基因修飾的DCs進行了FACS分析,以明確AdTGF-beta1轉(zhuǎn)基因?qū)Cs成熟過程的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)未處理組的細胞表現(xiàn)出未成熟DCs的表型,Ad Lac Z轉(zhuǎn)染并未使這種細胞特征發(fā)生很大的變化。Ad TGF-beta1轉(zhuǎn)染后DCs表面的MHC-Ⅱ,CD80,CD86和CD40表達均受到抑制,而對CD80的抑制作用最為明顯。 研究證明IL-12是DC分泌的主要細胞因子之一,其主要作用是促使T細胞向T輔助細胞1(Th1)轉(zhuǎn)化并大量分泌IL-2和IFN-γ,從而激發(fā)強有力的免疫應(yīng)答。IL-12的合成分泌能力是DC主要功能指標(biāo)之一,不僅能夠提示DC的成熟狀態(tài),而且是DC擁有免疫原性還是耐受原性的指針之一。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)無處理對照組和Ad Lac Z轉(zhuǎn)染組DC在LPS刺激下能夠迅速成熟并分泌大量IL-12,而Ad TGF-beta1轉(zhuǎn)染后DC分泌的IL-12較對照為低,在LPS刺激后IL-12濃度的提升幅度較小,反映AdTGF-beta1轉(zhuǎn)染后的DC擁有了對LPS等致成熟因子的抗性。 不同處理組DC與同種小鼠脾T細胞做120h混合淋巴細胞反應(yīng),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)對照組DC,Ad TGF-beta1轉(zhuǎn)染的DC刺激同種T細胞的能力明顯受到抑制,而Ad LacZ轉(zhuǎn)染的DC刺激同種T細胞的能力較對照組DC有輕微的提升。這與其細胞表型特征及分泌IL-12的能力是一致的。 我們實現(xiàn)了AdTGF-beta1對DC的高效感染,獲得了穩(wěn)定表達未成熟DC表型的Ad TGF-beta1基因修飾DC,并在體外證實了其對T細胞的抑制能力,顯示其具有免疫耐受性DC的特征。在此基礎(chǔ)上,我們分離純化了Ad TGF-beta1基因修飾DC上清來源的exosomes,在1*10~6的DC的上清中,前24h可以穩(wěn)定分離得到1μg的exosomes,此后隨著DC的大量凋亡,exosomes的得率相應(yīng)降低,考慮到隨時間的推移,DC會逐漸趨于成熟,我們只收集了前48h的exosomes。對exosomes的電鏡分析結(jié)果顯示,我們分離得到的exosomes主要是直徑集中在50-100nm左右的小囊泡,具有典型的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu),這與文獻報道相一致。將exosomes吸附到乳膠顆粒之后,通過FACS對其表型進行了分析,顯示AdTGF-beta1-exo低表達MHC-Ⅱ類分子、CD80,幾乎不表達CD86與CD40,提示其可能具有免疫調(diào)節(jié)功能。同時exosomes表面還表達小鼠DC特征性的標(biāo)志CD11c,證實了其屬于DC來源。對exosomes的Westernblot(WB)結(jié)果表明,我們分離得到的exosomes表達exosomes特征性的蛋白Tsg101和Hsp70。Tsg101是內(nèi)體相關(guān)的蛋白,參與exosomes的形成,也證實了其內(nèi)體的來源,而較Ad Lac Z基因修飾DC來源的exosomes(Lac Z-exo)及未處理DC來源的exosomes(Control-exo),TGF-beta1-exo表達較低的Hsp70,而Hsp70在體內(nèi)可以將免疫耐受狀態(tài)的T細胞轉(zhuǎn)化為自體反應(yīng)性T細胞,進一步提示了TGF-beta1-exo具有免疫調(diào)節(jié)功能。與Control-exo和Lac Z-exo相比,只有TGF-beta1-eXO表達TGF-beta1,說明TGF-beta1基因修飾的DC能夠以一種未知的機制將TGF-beta1攜帶到exosomes上。通過ELISA我們對TGF-beta1-exo上的TGF-beta1進行了定量,經(jīng)反復(fù)凍融與未凍融TGF-beta1-exo上含有的TGF-beta1水平有所差別,分別是15pg和8pg/μg exosomes,說明在exosomes上同時存在著分泌型與膜型的TGF-beta1。在不同處理組exosomes對同種小鼠120h混合淋巴細胞反應(yīng)影響效應(yīng)的實驗中顯示,TGF-betal-exo可以明顯抑制小鼠T細胞的增殖,而Control-exo和Lac Z-exo對T細胞亦有微弱的抑制作用TGF-beta1-exo除了對T細胞的抑制作用,我們還發(fā)現(xiàn)TGF-beta1-exo還可以抑制Con A引起的淋巴細胞的活化,進一步證實了TGF-beta1-exo的免疫抑制功能。 綜上所述,我們成功的分離純化了Ad TGF-beta1基因修飾DC來源的exosomes,并通過電鏡,FACS及WB對其形態(tài),蛋白表達進行了鑒定,并在體外證實了其對T細胞的抑制效果,這為下一步的體內(nèi)實驗奠定了基礎(chǔ)。 第二部分 TGF-beta1基因修飾的骨髓未成熟樹突狀細胞來源的exosomos對DSS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性腸病的保護作用及其相關(guān)機制 為了進一步檢驗TGF-beta1-exo的免疫抑制功能,明確在體內(nèi)環(huán)境下TGF-beta1-exo是否能同樣的發(fā)揮免疫抑制的功能,我們將TGF-beta1-exo經(jīng)腹腔注射小鼠,通過觀察小鼠體重的改變情況,大便性狀,便血情況,以及腸道組織的病理切片分析,判斷TGF-beta1-exo是否能夠延緩DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD的進展過程,并對其機制進行了探討。 我們通過讓C57BL/6小鼠連續(xù)自由飲用濃度為1.5%的DSS 9天,來誘導(dǎo)小鼠IBD的發(fā)病。并在小鼠飲用DSS前兩天,經(jīng)腹腔分別注射10μg/只的Control-exo、Lac Z-exo和TGF-beta1-exo,并于飲用DSS后第3天,第5天經(jīng)腹腔再追加注射10μg/只的各組exosomes。同時設(shè)正常飲水的對照組及未經(jīng)任何處理單純飲用DSS組。除經(jīng)TGF-beta1-CXO處理的小鼠,其它各組小鼠在飲用DSS 5天后體重呈進行性下降,至第9天,DSS組、Control-exo組及Lac Z-exo組小鼠的體重分別下降了16%、15%、15%。而TGF-beta1-exo組小鼠的體重在第6天才開始下降,并且下降的程度相對緩慢,至第9天,體重僅下降了5%。除此之外,聯(lián)合了體重改變,大便性狀,便血情況,對小鼠IBD進展情況進行綜合評價的每天疾病活躍指數(shù)(daily diseaseactivity index,DAI)的評分結(jié)果亦顯示了TGF-beta1-exo能較大程度的延緩DSS誘導(dǎo)的小鼠的IBD的進展速度。而第7天的各組小鼠便隱血測試結(jié)果顯示,TGF-beta1-exo組小鼠雖然也出現(xiàn)了較為明顯的大便隱血,但與其它各組相比,在便血程度上明顯要輕一些。最后,各組小鼠結(jié)腸病理切片結(jié)果進一步提示了TGF-beta1-exo在小鼠IBD進展過程中的保護作用。在TGF-beta1-exo組小鼠結(jié)腸組織的切片中除了可見到粘膜和粘膜下層輕到中等程度的炎癥細胞浸潤,腸粘膜腺體結(jié)構(gòu)還比較完整。而其它各組小鼠在粘膜層,粘膜下層均可見到重度的炎癥細胞浸潤,并可見到彌散至肌層的炎癥細胞浸潤,局部還可見到粘膜結(jié)構(gòu)的破壞,正常腺體結(jié)構(gòu)的消失。 為了探討TGF-beta1-exo延緩DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD進展過程的相關(guān)機制,分析TGF-beta1-exo是否能夠誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生,從而在一定程度上恢復(fù)腸道的免疫平衡,我們分離了各組小鼠脾臟及結(jié)腸系膜淋巴結(jié)來源的淋巴細胞,分析Foxp3~+ Treg的改變情況。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn),與其它組小鼠相比,TGF-beta1-exo組小鼠脾臟Foxp3~+Treg并未發(fā)生明顯的改變,而在炎癥局部結(jié)腸系膜來源的淋巴細胞中,可以觀察到Foxp3~+ Treg的明顯上調(diào)。為進一步分析這種差別產(chǎn)生的原因,我們用羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(5,6-carboxyfluorescein diacetate succimidyl ester,CFSE)對exosomes進行標(biāo)記,然后將標(biāo)記的exosomes與IBD或正常小鼠小鼠脾臟及結(jié)腸系膜淋巴結(jié)來源的淋巴細胞共培養(yǎng)后,觀察不同來源淋巴細胞對exosomes的內(nèi)化情況。我們發(fā)現(xiàn),與正常小鼠結(jié)腸系膜來源的淋巴細胞相比,IBD小鼠結(jié)腸系膜來源的淋巴細胞能夠內(nèi)化更多的exosomes,而這種差異在IBD小鼠與正常小鼠的脾臟淋巴細胞中并不能觀察到。 綜合以上結(jié)果可以看出,TGF-beta1-exo能夠明顯延緩DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD的進展速度,而不像它們在體外MLR中觀察到的輕微的抑制作用,Contro-exo和LacZ-exo對DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD的進展并未顯示出任何保護性作用。與其它組exosomes相比,經(jīng)TGF-beta1-exo處理之后的小鼠,在炎癥局部來源的淋巴細胞中,可以觀察到Foxp3~+Treg的明顯上調(diào),這可能是TGF-beta1-exo能夠明顯延緩DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD的進展速度的機制之一。而能在炎癥局部淋巴細胞觀察到Foxp3~+Treg的上調(diào)而不是脾臟淋巴細胞,原因之一,很有可能是因為炎癥局部的淋巴細胞能夠富集更多的TGF-beta1-exo而造成局部的高濃度TGF-betal。
【圖文】：

轉(zhuǎn)AdTGF一betal后DC對LPS的抵抗作用Fig.3TGF一befalgenemodi五edBMDCscanresistthema加rationeffectofLPS.

形態(tài)學(xué)觀察和節(jié)幾stemblot分析，如圖5所示。在超微結(jié)構(gòu)水平，我們利用透電鏡技術(shù)觀察了cxosomes的結(jié)構(gòu)。如圖SA所示，我們得到的cxosomes為直介于50一100nm，具有典型脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的小囊泡，符合exosomes的形態(tài)特征。對exosomes的W七stemblot分析結(jié)果顯示，我們分離得到的各組DC來的exosomes均表達exosomes的標(biāo)志蛋白H印70以及Tsg101。其中Tsg101是體相關(guān)的蛋白，參與exosomes的形成。而Hsp70是熱休克蛋白家族的一個成，在體內(nèi)，其可以將處于免疫耐受狀態(tài)下的T細胞轉(zhuǎn)化為自體反應(yīng)性T細胞。們的結(jié)果顯示，，與Control一exo以及uez一exo比，TGF一betal一exo表達較低的sP70，這也提示了TGF一betal一exo具有免疫調(diào)節(jié)功能。同時我們發(fā)現(xiàn)只有轉(zhuǎn)染了TGF一betal的DC來源的cxosomes含有TGF一betal，說明TGF一betal基因修飾DC能將其分泌的TGF一betal以一種未知的機制轉(zhuǎn)移到exosomcs上。OXg。尸利口e祠·U-巴l
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392;R574

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;Dendritic Cells Transduced with SOCS1 Gene Exhibit Regulatory DC Properties and Prolong Allograft Survival[J];Cellular & Molecular Immunology;2009年02期

2 宮德正,鄒原,梅懋華;腸粘膜免疫系統(tǒng)與細胞因子[J];大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2002年01期

3 韓欽,尤勝國;人工誘導(dǎo)免疫耐受[J];國外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊;2003年05期

4 張勇;楊曉梅;呂毅;;樹突狀細胞誘導(dǎo)肝移植免疫耐受新進展[J];國際外科學(xué)雜志;2006年04期

5 聶虎;何慶;何斌;;病人危險度評分在急診的應(yīng)用[J];華西醫(yī)學(xué);2006年04期

6 趙金平;李平;高思海;王現(xiàn)國;高小見;;轉(zhuǎn)化生長因子-β_1對心臟移植排斥反應(yīng)中心肌細胞凋亡的影響[J];臨床心血管病雜志;2007年09期

7 郭慶東;李兵;章翔;秦衛(wèi)軍;王福利;田豐;郭應(yīng)祿;溫中華;;TGF-β_1基因轉(zhuǎn)染對未成熟樹突狀細胞表型和功能的影響[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2008年03期

8 Andreas Sturm;Axel U Dignass;;Epithelial restitution and wound healing in inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2008年03期

9 Lydia Hui Mei Ng;Wai Ling Chow;Yuan Kun Lee;;Infant intestinal Enterococcus faecalis down-regulates inflammatory responses in human intestinal cell lines[J];World Journal of Gastroenterology;2008年07期

10 吳文橋;單娟;李幼平;羅蕾;孫桂香;周彥妮;楊彤;夏夢娟;郭穎嘉;馮莉;;不同途徑過繼回輸致耐受樹突狀細胞延長小鼠移植心臟存活研究的系統(tǒng)評價[J];中國循證醫(yī)學(xué)雜志;2012年12期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 牟海波;受者來源的轉(zhuǎn)化生長因子β1處理的樹突狀細胞誘導(dǎo)異基因骨髓移植免疫耐受研究[D];浙江大學(xué);2005年

2 廖東山;細胞凋亡在心臟移植中的作用及聚乙烯亞胺介導(dǎo)FasL基因轉(zhuǎn)染對大鼠同種異體心臟移植的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2005年

3 吳奎;屋塵螨過敏原轉(zhuǎn)染樹突狀細胞誘導(dǎo)哮喘小鼠免疫耐受的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2005年

4 趙金平;轉(zhuǎn)化生長因子β1抗心臟移植排斥反應(yīng)的作用及機制研究[D];華中科技大學(xué);2006年

5 楊偉峰;益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株治療小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎的研究[D];中南大學(xué);2007年

6 張旭東;同種異體顏面移植基礎(chǔ)與應(yīng)用研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2007年

7 蘇紀(jì)權(quán);RNAi干擾樹突狀細胞CD40基因?qū)σ浦才懦夥磻?yīng)影響的體外研究[D];吉林大學(xué);2007年

8 陳麗紅;IL-10和TGF-β1基因共修飾樹突狀細胞誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2008年

9 邱明鏈;FasL和TGF-β1基因共修飾樹突狀細胞誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2008年

10 王學(xué)紅;防治潰瘍性結(jié)腸炎的益生菌的篩選及其部分機制的研究[D];中南大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前8條

1 周玉俠;細胞因子對外周血樹突狀細胞的體外誘導(dǎo)成熟及其功能影響[D];山東大學(xué);2005年

2 楊麗;Smad分子在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達研究[D];四川大學(xué);2005年

3 厲倩;肺臟基質(zhì)細胞誘導(dǎo)不成熟樹突狀細胞為調(diào)節(jié)性樹突狀細胞的研究[D];浙江大學(xué);2006年

4 孫安娜;腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)不成熟樹突狀細胞為調(diào)節(jié)性樹突狀細胞的研究[D];浙江大學(xué);2007年

5 張程亮;樹突狀細胞在1型糖尿病免疫耐受中的作用研究[D];華中科技大學(xué);2007年

6 張晶;大鼠脾臟來源樹突狀細胞的IDO表達對T淋巴細胞增殖的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2009年

7 蔡圣鑫;STAT1在G-CSF誘導(dǎo)異基因造血干細胞移植供者T細胞免疫耐受中的作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2009年

8 李智君;蘇木乙酸乙酯提取物對大鼠心臟移植慢性排斥模型血清TGF-β1的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2012年

本文編號：2542074