發(fā)布時間：2019-09-22 07:25

【摘要】： 背景: Tiam1(T-lymphoma invasion and metastasis inducing protein 1,T淋巴細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)蛋白1)是一種鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)換因子,其編碼蛋白質(zhì)與GDP分化刺激因子(GDS)的Dbl(DH)區(qū)域具有較高同源性。該基因的過表達(dá)可激活Rho樣GTP酶Racl,而活性的Rac1在細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞粘附與運(yùn)動、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)細(xì)胞軸突與樹突的形成及細(xì)胞周期調(diào)控等過程中發(fā)揮著重要。Tiam1蛋白可調(diào)節(jié)粘附分子介導(dǎo)的細(xì)胞粘附,參與粘附復(fù)合物的組裝,誘導(dǎo)腫瘤的侵襲,并且介導(dǎo)蛋白復(fù)合物的形成及膜定位,參與蛋白質(zhì)間的相互作用[1,2]。 胚胎植入是一個復(fù)雜的過程,涉及到母體子宮與胚胎之間多因素的精細(xì)調(diào)控,包括胚胎的定位、附著及侵入子宮內(nèi)膜、細(xì)胞外基質(zhì)的廣泛性降解和重塑、滋養(yǎng)層細(xì)胞介導(dǎo)下侵入到母體子宮內(nèi)膜細(xì)胞中和母體子宮內(nèi)膜細(xì)胞分泌等[3,4,5]。對于胚胎著床來說,胚胎發(fā)育和子宮內(nèi)膜修飾之間的同步化是至關(guān)重要的[3,6]。 最近幾年,Tiam1在腫瘤發(fā)生中參與了腫瘤細(xì)胞遷移、粘附和侵襲及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等過程中的作用已被提出并大量研究,由于胚胎植入與腫瘤侵襲過程很大程度上具有相似性[7],Tiam1是否在胚胎植入過程中起一定作用,對其進(jìn)行研究將具有很重要的意義。 前期的研究表明:①Tiam1在動情期小鼠子宮內(nèi)膜高表達(dá);②在早孕小鼠的子宮內(nèi)膜中,Tiam1在基質(zhì)細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá),且隨著妊娠天數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢,在妊娠第五天達(dá)到最高值[8]。推測Tiam1可能通過調(diào)節(jié)粘附分子介導(dǎo)的細(xì)胞粘附作用促使胚泡的移動、定位和粘附,并可能在胚泡植入的侵襲期間n 入了滋養(yǎng)層的侵襲及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等過程有關(guān)。 目的:通過檢測Tiam1在著床窗口期小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況,探討在體外試驗中封閉Tiam1功能后對胚泡粘附的影響。 方法: 1、采用胰蛋白酶消化與機(jī)械振蕩相結(jié)合法提取著床窗口期小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞,采用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定基質(zhì)細(xì)胞及其細(xì)胞純度并對其生長狀況進(jìn)行顯微觀察。 (1)運(yùn)用RT-PCR檢測Tiam1mRNA在著床窗口期和未孕小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。 (2)運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Tiam1蛋白在著床窗口期和未孕小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。 2、建立體外著床窗口期小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞、胚泡共培養(yǎng)體系,用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將抗Tiam1抗體分別稀釋成0mg/L、100mg/L、200mg/L和400mg/L的濃度梯度。采用不同的抗體濃度干擾共培養(yǎng)體系,運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot檢測Tiam1蛋白的表達(dá),并計數(shù)不同濃度下胚泡的粘附數(shù)。 (1)采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測抗Tiam1抗體不同濃度下著床窗口期和未加抗Tiam1抗體下小鼠基質(zhì)細(xì)胞中Tiam1蛋白的表達(dá)情況。 (2)采用Western blot法檢測抗Tiam1抗體不同濃度下著床窗口期和未加抗Tiam1抗體下小鼠基質(zhì)細(xì)胞中Tiam1蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果: 1、經(jīng)過免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定后,獲得著床窗口期基質(zhì)細(xì)胞純度為93.8±0.5%,顯微觀察發(fā)現(xiàn),基質(zhì)細(xì)胞接種24h后大部分細(xì)胞已貼壁,培養(yǎng)3d后細(xì)胞排列緊密、形態(tài)為長梭形。 (1) RT-PCR: Tiam1mRNA在著床窗口期小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中較強(qiáng)表達(dá),而在未孕小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中弱表達(dá)。 (2)免疫細(xì)胞化學(xué): Tiam1蛋白在著床窗口期小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng)。在未孕小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中,Tiam1蛋白表達(dá)較弱。 2、不同的抗體濃度干擾共培養(yǎng)體系中,在抗體濃度分別為0 mg/L、100mg/L、200mg/L和400mg/L時,胚泡的粘附率分別為34.41%、24.00%、20.62%和13.82%,抗體處理組和對照組之間有明顯的差異性(p0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測結(jié)果表明,隨著抗Tiam1抗體濃度的增加,Tiam1蛋白的表達(dá)量逐漸下降,同時胚泡的粘附率也逐漸降低。 結(jié)論: Tiam1在著床窗口期小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)。在體外著床窗口期小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞、胚泡共培養(yǎng)體系中,加入抗Tiam1抗體于共培養(yǎng)體系后發(fā)現(xiàn),隨著抗Tiam1抗體濃度的增加胚泡的粘附率呈現(xiàn)降低的趨勢。以上研究結(jié)果表明Tiam1可能在胚泡植入過程中參與了胚泡的定位、粘附及侵襲等生理作用。
【圖文】：

化學(xué)隨機(jī)選擇 5 個高倍視野觀察細(xì)胞有無棕黃染色。1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以 X±s 表示，采用 SPSS13.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。2 結(jié)果2.1 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞生長狀況顯微觀察倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，酶消化后的子宮內(nèi)膜明顯變薄，變得疏松，消化液變得渾濁，所獲得的細(xì)胞大部分呈單個分散的圓形，細(xì)胞有少量細(xì)胞團(tuán)。基質(zhì)細(xì)胞于接種 0.5h 后開始貼壁，接種 24h 后大部分細(xì)胞已貼壁，細(xì)胞呈短梭形或多角形（見圖 1）。培養(yǎng) 2d 后細(xì)胞生長旺盛，大部分為長梭形，幾乎無多邊形細(xì)胞，基本上鋪滿培養(yǎng)板（見圖 2），可以連續(xù)培養(yǎng) 5d，不可以傳代。

化學(xué)隨機(jī)選擇 5 個高倍視野觀察細(xì)胞有無棕黃染色。1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以 X±s 表示，采用 SPSS13.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。2 結(jié)果2.1 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞生長狀況顯微觀察倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，酶消化后的子宮內(nèi)膜明顯變薄，變得疏松，消化液變得渾濁，所獲得的細(xì)胞大部分呈單個分散的圓形，細(xì)胞有少量細(xì)胞團(tuán)。基質(zhì)細(xì)胞于接種 0.5h 后開始貼壁，接種 24h 后大部分細(xì)胞已貼壁，細(xì)胞呈短梭形或多角形（見圖 1）。培養(yǎng) 2d 后細(xì)胞生長旺盛，，大部分為長梭形，幾乎無多邊形細(xì)胞，基本上鋪滿培養(yǎng)板（見圖 2），可以連續(xù)培養(yǎng) 5d，不可以傳代。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R321

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本文編號：2539836