【摘要】：人乳頭瘤病毒(Human Papillomaviruses, HPV)是重要的傳染性致病因子,可引起人體不同部位皮膚和粘膜的增生性疾病及惡性腫瘤。根據(jù)其致病性的不同,可分為低危型別和高危型別,高危型別與宮頸癌密切相關(guān),低危型別則與皮膚生殖器疣相關(guān)。生殖器疣(Genital Wart, GW)是目前世界上最流行的性傳播疾病之一。雖然GW一般不會(huì)導(dǎo)致死亡,但是會(huì)使患者產(chǎn)生心理陰影,并帶來(lái)昂貴的治療費(fèi)用。GW與HPV感染的密切關(guān)系早已明確,其中以HPV-6、11型為主。目前治療GW的常見(jiàn)方法有物理療法(如冷凍、激光等)和藥物治療,雖然見(jiàn)效快,能在短時(shí)間內(nèi)清除疣體,卻不能徹底清除腫瘤細(xì)胞或被病毒感染的細(xì)胞,故極易復(fù)發(fā)。這就需要尋找更為有效的預(yù)防和治療GW的方法。 HPV疫苗可分為預(yù)防性和治療性疫苗。目前預(yù)防性疫苗已取得了重要進(jìn)展,Merck和GSK公司的HPV預(yù)防性疫苗已經(jīng)上市,其主要策略集中在誘發(fā)出針對(duì)HPV衣殼蛋白L1的相關(guān)構(gòu)象依賴表位的高滴度中和抗體來(lái)預(yù)防感染；治療性疫苗的研究進(jìn)展則相對(duì)緩慢,其主要機(jī)制是通過(guò)誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)病毒抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng),從而清除腫瘤細(xì)胞或被病毒感染的細(xì)胞。由于HPV早期蛋白E6、E7在病毒生活周期中持續(xù)存在,已經(jīng)成為當(dāng)前多數(shù)治療性疫苗選擇的靶抗原。針對(duì)高危型別的HPV16/18型治療性疫苗已進(jìn)行了較多的Ⅱ期臨床研究,并獲得一定的治療效果；而針對(duì)低危型別的研究較少,只有GSK公司一家研制的HPV6型L2E7融合蛋白治療性疫苗進(jìn)行了Ⅱ期臨床,對(duì)僅感染HPV6型的GW有一定的治療效果。 本論文的設(shè)計(jì)思路是：在HPV6型L2E7融合蛋白的基礎(chǔ)上,加入近年來(lái)臨床研究中發(fā)現(xiàn)的具有更強(qiáng)免疫原性的E6蛋白,構(gòu)建L2E7E6融合蛋白。考慮到全長(zhǎng)L2與E7、E6基因融合可能影響蛋白的表達(dá)水平,選擇將5’端360bp,600bp和全長(zhǎng)3種不同長(zhǎng)度的L2基因片段與E7、E6基因進(jìn)行融合。利用IFN-γELISPOT.ELISA.HPV6型假病毒中和試驗(yàn)來(lái)比較各融合蛋白的細(xì)胞和體液免疫效果,篩選一種融合蛋白對(duì)其免疫指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)化評(píng)價(jià),包括相關(guān)T細(xì)胞表位的篩選及亞型的確定。主要研究結(jié)果如下： 1.構(gòu)建了HPV6型L2、E7、E6基因的原核表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)并純化了His-6L2、GST-6E7、GST-6E6蛋白,純化后的蛋白能用于相應(yīng)抗體水平的ELISA檢測(cè)。 2.構(gòu)建了HPV6型L2的3種不同長(zhǎng)度基因片段與E7、E6基因融合的原核表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)、鑒定并純化了6L2360E7E6、6L2600E7E6蛋白。動(dòng)物免疫及效果評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,2種蛋白在CpG佐劑作用下均能在C57BL/6小鼠體內(nèi)誘發(fā)強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng),但2種蛋白免疫效果之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,針對(duì)同型假病毒的中和抗體滴度均為1：2560。 3.選擇原核表達(dá)水平較高的6L2360E7E6蛋白做進(jìn)一步的免疫效果評(píng)價(jià)。在細(xì)胞免疫方面,6L2360E7E6+CpG佐劑最優(yōu),其次是6L2360E7E6無(wú)佐劑組,6L2360E7E6+Al(OH)3佐劑弱；ELISA結(jié)果顯示,各組IgG抗體水平無(wú)顯著差異；假病毒中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,6L2360E7E6+CpG誘發(fā)的針對(duì)HPV6、11、16、18、58、45型假病毒的中和抗體及交叉中和抗體滴度分別為1：3200、1：1600、1：800、1：800、1：200、1：800；小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,6L2360E7E6+CpG佐劑能明顯延遲腫瘤細(xì)胞的成瘤時(shí)間并抑制腫瘤生長(zhǎng),且有部分小鼠腫瘤生長(zhǎng)得到完全抑制。 4.分別篩選出了C57BL/6小鼠HPV6型E7、E6蛋白反應(yīng)最強(qiáng)的E71_15和E637-51肽段,位于其中的T細(xì)胞表位均為8肽,具體氨基酸序列分別為N'-VTLKDIVL-C'和N'-YSYAYKHL-C'；胞內(nèi)細(xì)胞因子染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)二者均為CD8+亞型T細(xì)胞表位；同時(shí),小鼠體內(nèi)CTL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示E637-51肽表位是強(qiáng)的CTL表位。 綜上所述,本研究獲得了能在原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)的HPV6型L2360E7E6融合蛋白,該融合蛋白在C57BL/6小鼠體內(nèi)能誘發(fā)強(qiáng)的CD8+T細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng),可作為HPV6型慢性感染及相關(guān)生殖器疣治療的候選疫苗。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙可佳,程浩,陳民利,丁志山,耿禮義,方永明;表達(dá)人乳頭瘤病毒6b和11型E6/E7基因的小鼠腫瘤細(xì)胞株的建立[J];中華皮膚科雜志;2004年02期

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本文編號(hào)：2538433