【摘要】：目的構(gòu)建弗氏志賀菌Htr A蛋白的可控表達(dá)菌株。方法構(gòu)建自殺質(zhì)粒同源重組載體,利用重組方法在基因組htr A前插入阿拉伯糖啟動(dòng)子,同時(shí)構(gòu)建并導(dǎo)入外源表達(dá)Ara C蛋白的表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)對(duì)Htr A蛋白的可控表達(dá);在此基礎(chǔ)上,通過(guò)蛋白印跡實(shí)驗(yàn),檢測(cè)誘導(dǎo)前后全菌以及周質(zhì)中Htr A蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果測(cè)序結(jié)果表明,自殺質(zhì)粒同源重組載體以及外源表達(dá)載體構(gòu)建成功;蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)比阿拉伯糖誘導(dǎo)菌株,未誘導(dǎo)菌株中基本未檢測(cè)到Htr A蛋白的表達(dá)。結(jié)論自殺質(zhì)粒同源重組方式可在無(wú)阿拉伯糖時(shí)有效阻遏Htr A蛋白的表達(dá);同時(shí)在誘導(dǎo)后,還可恢復(fù)Htr A蛋白的正常表達(dá),有利于后續(xù)功能研究。
【圖文】：

rA重組載體，將araC連入pACYCl84載體中構(gòu)建pACD-araC重組載體;連接產(chǎn)物各自轉(zhuǎn)化入E．coliDH5α和S17感受態(tài)中，挑選單克隆DH5α/pACD-araC和S17/pGD-htrA，振蕩培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。PCＲ驗(yàn)證正確后送至明琛志遠(yuǎn)公司測(cè)序。1．3可控表達(dá)株的構(gòu)建振蕩培養(yǎng)DH5α/pACD-araC和S17/pGD-htrA菌株并提取質(zhì)粒。取5μlpACD-araC質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入已制備的301感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，傳代后制備301/pACD-araC感受態(tài)細(xì)胞并將5μlpGD-htrA質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入其中，利用Amp、Cm雙抗性篩選陽(yáng)性克隆，振蕩培養(yǎng)并利用PBADa/htrAP2引物進(jìn)行PCＲ驗(yàn)證(圖1)。圖1自殺質(zhì)粒pGD-htrA同源重組示意圖1．4全菌蛋白的制備將電轉(zhuǎn)制備的301/pGD-htrA/pACD-araC菌液置于37℃振蕩培養(yǎng)，其中不加阿拉伯糖誘導(dǎo)為HtrA沉默株，加阿拉伯糖誘導(dǎo)為HtrA誘導(dǎo)表達(dá)菌株。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期(約7．5h)收集菌體，加入2×SDS上樣緩沖液，煮沸10min，13000r/min離心2min，取上清液即為全菌蛋白樣品。1．5周質(zhì)蛋白的制備［7］轉(zhuǎn)接301/pGD-htrA/pACD-araC阿拉伯糖誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)菌株菌液于37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期(7．5h)，6000r/min離心8min收集菌體，用1×PBS洗2次后加入100μl裂解液(20%蔗糖，30mmol/LTris-Cl，pH8．0，1mmol/LEDTA，1mg/ml溶菌酶)重懸菌體，冰浴中輕輕振蕩15min，6000r/min離心15min，收集上清即為周質(zhì)蛋白。加入2×SDS上樣緩沖液，煮沸10min，13000r/min離心2min，制備周質(zhì)蛋白樣品。1．6Western印跡檢測(cè)將已制備的全菌蛋白以及周質(zhì)蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;用5%脫脂奶粉于4℃封閉過(guò)夜，用TBST1∶1000稀釋的HtrA抗體室溫孵育，，輕搖1h后TBST洗膜3次，每次5min;用TBST1∶5000稀釋的羊抗鼠單克隆抗體室溫孵育，輕搖1h后TBST洗膜3次，每次5min，用化

圖2PCＲ擴(kuò)增PBADa-htrA100(A)和araC(B)目的基因A:M．Trans2KplusⅡDNA標(biāo)志物;1．PBADa-htrA100目的基因;B:M．DL2000DNA標(biāo)志物;1．a(chǎn)raC目的基因2．2自殺質(zhì)粒同源重組菌株構(gòu)建取5μlpACD-araC質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入已制備PBADa-htrA100目的基因的301感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，傳代后制備301/pACD-araC感受態(tài)細(xì)胞并將5μlpGD-htrA質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入其中，利用Amp、Cm雙抗性篩選陽(yáng)性克隆，初步驗(yàn)證自殺質(zhì)粒pGD-htrA已重組到301基因組上。進(jìn)一步利用引物PBADa與htrAP2進(jìn)行PCＲ擴(kuò)增(圖3)，最終證明自殺質(zhì)粒靶向地與301基因組上的htrA基因重組，順利插入到htrA基因中，成功在基因組水平上將htrA基因上游加入阿拉伯糖啟動(dòng)子，可以進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。圖3自殺質(zhì)粒同源重組成功菌液的PCＲ驗(yàn)證M．Trans2KplusⅡDNA標(biāo)志物;1．301-pGD-htrA/pACD-araC菌液;2．301/pACD-araC陰性對(duì)照2．3Western印跡檢測(cè)自殺質(zhì)粒同源重組方法缺失htrA制備htrA沉默表達(dá)菌株以及誘導(dǎo)表達(dá)菌株的全菌蛋白和周質(zhì)蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE，Western印跡檢測(cè)HtrA蛋白的表達(dá)情況。利用自殺質(zhì)粒同源重組構(gòu)建的301/pGD-htrA/pACD-araC加入阿拉伯糖誘導(dǎo)時(shí)，HtrA抗體在相對(duì)分子質(zhì)量約50×103處檢測(cè)到明顯特異性條帶，而與之相對(duì)應(yīng)的無(wú)阿拉伯糖誘導(dǎo)時(shí)，同等位置沒(méi)有明顯條帶(圖4A)。在提取的周質(zhì)蛋白中，加入阿拉伯糖誘導(dǎo)時(shí)，周質(zhì)中HtrA抗體在50×103附近檢測(cè)到明顯特異性條帶，而無(wú)阿拉伯糖誘導(dǎo)時(shí)，周質(zhì)中未檢測(cè)到HtrA的存在(圖4B)。這說(shuō)明自殺質(zhì)粒同源重組的方式可以高效地敲低HtrA蛋白的表達(dá)，同時(shí)又可以通過(guò)阿拉伯糖誘導(dǎo)的方式使其表達(dá)。圖4SDS-PAGE檢測(cè)301/pGD-htrA/pACD-araC菌株的全菌蛋白(A)和周質(zhì)蛋白(B)3討論革蘭陰性致病菌志賀菌屬，具有極強(qiáng)的傳染性和致病性。HtrA蛋?
【作者單位】： 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171531,81125012,81373316) 國(guó)家973計(jì)劃資助項(xiàng)目(2011CB504901,2013CB910804)
【分類號(hào)】：R378.25

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2536807