【摘要】： 研究背景:Schlafen(Slfn)家族基因是Schwarz DA等于1998年發(fā)現(xiàn)的參與調(diào)控胸腺發(fā)育的基因,目前對其所知甚少,所有國內(nèi)外公開發(fā)表的文獻只有6篇,僅有的研究表明,該家族基因缺陷可引起一種胚胎致死性表型-DDK綜合癥。Schlafen家族基因作為一類新發(fā)現(xiàn)的基因,其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。Schlafen1(Slfn1)基因可通過拮抗對Cyclin D1的誘導(dǎo),從而導(dǎo)致細(xì)胞周期終止于G1期。對于Schlafen2(Slfn2)的基因功能目前還不清楚,而且尚未建成能夠穩(wěn)定表達Slfn2基因的細(xì)胞系,使其進一步研究收到了限制。因此,探索Slfn2的基因功能對于細(xì)胞在基因水平上的研究是一項嶄新的課題,這勢必為人類基因組的研究進展提供新的視角,從而展開更加多元化的系統(tǒng)研究。 目的:(1)將Slfn2基因轉(zhuǎn)入NIH/Swiss小鼠胚胎來源的纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞NIH/3T3中,通過綠色熒光蛋白標(biāo)記觀察細(xì)胞中Slfn2基因的表達及分布;(2)建立Slfn2基因穩(wěn)定表達的細(xì)胞系以進一步研究其生物學(xué)功能;(3)克隆Slfn2基因啟動子區(qū)序列,為今后構(gòu)建雙報告基因表達載體、檢測熒光素酶的相對活性從而確定和研究小鼠Slfn2啟動子的大致區(qū)域和相對活性奠定基礎(chǔ)。 方法:(1)克隆Slfn2基因全編碼區(qū)序列;(2)構(gòu)建pEGFP-Slfn2及PCI-neo.Slfn2真核表達載體;(3)瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-Slfn2載體及其空載體對照至NIH/3T3細(xì)胞,激光共聚焦顯微技術(shù)觀察細(xì)胞中Slfn2基因的表達及分布;(4)用脂質(zhì)體Lipofectamine~(TM)2000分別轉(zhuǎn)染pEGFP-Slfn2與pCI-Sifn2.neo及相應(yīng)空載體對照至NIH/3T3細(xì)胞,G418篩選獲得抵制的細(xì)胞株;(5)用Northern blot核酸分子雜交技術(shù)進一步鑒定Slfn2在各細(xì)胞株中的表達情況:(6)利用細(xì)胞生長曲線和Transwell侵襲實驗檢測Slfn2對細(xì)胞增殖及遷移能力的影響。(7)克隆Slfn2基因啟動子區(qū)序列,以便后期將該序列重組至熒光素酶報告載體pGL3-Basic上,連接形成真核表達載體,與pRL-CMV共轉(zhuǎn)染至NIH/3T3細(xì)胞,通過雙熒光素酶活性的測定來確定和研究小鼠Slfn2啟動子的大致區(qū)域和相對活性。 結(jié)果: 1.RT-PCR擴增出Slfn2全編碼區(qū)序列片段,測序分析結(jié)果表明與Genebank中登錄的Slfn2序列一致。 2.所構(gòu)建的pEGFP-Slfn2及PCI-Slfn2.neo真核表達載體經(jīng)酶切鑒定并測序,結(jié)果表明Slfn2基因與表達載體連接方向正確且無突變,可以進行轉(zhuǎn)染。 3.瞬時轉(zhuǎn)染對照及pEGFP-Slfn2質(zhì)粒,激光共聚焦顯微鏡下NIH/3T3細(xì)胞中核、漿均可見到綠色熒光,說明Slfn2在細(xì)胞核、漿均有表達。 4.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-Slfn2載體及pCI-Slfn2.neo及其相應(yīng)的空載體對照于NIH/3T3細(xì)胞中,G418篩選得到抵制的細(xì)胞克隆;用Northern blot核酸分子雜交技術(shù)鑒定并篩選出表達Slfn2的陽性細(xì)胞株;擴增培養(yǎng)建立細(xì)胞系。實驗中獲得的陽性細(xì)胞株中Slfn2基因均可正確、穩(wěn)定地表達。 5.繪制轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長曲線:穩(wěn)定表達Slfn2基因的細(xì)胞增殖速度明顯減慢。 6.利用Transwell腫瘤細(xì)胞侵襲實驗分析和檢測轉(zhuǎn)染后NIH/3T3細(xì)胞的遷移能力:Sifn2基因穩(wěn)定表達的腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力顯著降低。 7.PCR擴增出Slfn2啟動子區(qū)序列片段,測序分析結(jié)果表明與Genebank中登錄的Slfn2序列一致。 結(jié)論:(1)Slfn2的真核表達載體構(gòu)建成功,首次獲得了Slfn2基因穩(wěn)定表達的細(xì)胞株。(2)Slfn2基因的穩(wěn)定表達可明顯影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性,對腫瘤的生長增殖和遷移能力起負(fù)性調(diào)控作用,有效減緩腫瘤增殖速度,限制腫瘤蔓延擴散,即Slfn2基因的表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及其轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用,可能是一個潛在的腫瘤抑制基因。(3)成功克隆出Slfn2基因啟動子區(qū)序列,可用于Slfn2啟動子大致區(qū)域和相對活性的進一步研究。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R346

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號：2536873