【摘要】： 目的:構建表達pGCsi-hmSD質粒,轉染前列腺癌PC-3細胞,觀察沉默hmSD基因對PC-3細胞增殖,遷移能力及MMP-2 mRNA表達的影響,為前列腺癌的基因治療提供靶向參考。 方法:RT-PCR檢測hmSD mRNA在PC-3細胞系的表達;以基因重組技術構建表達pGCsi-hmSD質粒,應用真核細胞轉染技術轉染前列腺癌PC-3細胞并檢測轉染效率;PC-3細胞轉染pGCsi-hmSD質粒后,RT-PCR檢測hmSD mRNA表達的變化,倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化,MTT檢測其對細胞增殖的影響,流式細胞術檢測細胞凋亡的改變;劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞遷移的變化,RT-PCR檢測轉染pGCsi-hmSD質粒PC-3細胞MMP-2 mRNA表達的改變。 結果:1.經(jīng)限制性酶切鑒定及DNA序列測定證實,成功構建了pGCsi-hmSD質粒;2.PC-3細胞轉染效率各組均大于50%,且各組轉染效率沒有差異。3. PC-3細胞轉染pGCsi-hmSD質粒后, RT-PCR檢測hmSDmRNA表達水平降低,倒置顯微鏡下觀察細胞數(shù)目減少,皺縮,MTT實驗結果表明細胞增殖受抑制,流式細胞術結果表明其促進細胞凋亡。4.劃痕實驗和Transwell實驗結果為PC-3細胞轉染pGCsi-hmSD質粒后細胞遷移能力降低,RT-PCR結果顯示MMP-2 mRNA表達下降。 結論: 1.成功構建了pGCsi-hmSD質粒,可特異性沉默PC-3細胞的hmSD表達。2.hmSD能夠促進PC-3細胞的增殖,抑制腫瘤細胞凋亡。3. hmSD-RNAi可降低PC-3細胞的遷移能力,可能與抑制MMP-2 mRNA表達有關。
【圖文】：

圖1 pGCsilencer-U6/Neo/GFP質粒圖譜劑的配制IMDM培養(yǎng)液：1000ml去離子水中加入IMDM 17.、鏈霉素各 10 萬單位。過濾除菌，，4℃保存。PBS 緩沖液(pH7.4)： 1000ml 去離子水，加入氯化 0.2g，磷酸氫二鈉 1.56g，氯化鉀 0.2g。高壓滅胎牛血清：已滅菌胎牛血清分裝,-20℃保存。細胞凍存液：IMDM 培養(yǎng)液中加入 20%胎4℃保存。MTT 的配制：稱取 50mg 的 MTT 溶于 10mlPBS 或色瓶中，4℃保存?zhèn)溆谩＜毎海阂?PBS 液配制，胰蛋白酶 0.25%；ED

2 hmSD mRNA在PC-3細胞系的表達核重組質粒的構建及鑒定模板寡核苷酸的設計設計原則，從 GeneBank(NM00665的靶序列, 并用 RNA structure4.2 預 測 , 最 終 確 定 了 三 條 DNA 寡1 針 對 其 編 碼 區(qū) 130-151 位 2 針 對 其 編 碼 區(qū) 220-241 位 3 針對其編碼區(qū) 839-860 位堿基序列Ⅰ酶切位點和反向的兩個一致的靶序列個非同源序列(TTCAAGAGA)所間隔。3′位點。預測 siRNA 靶序列二級結構如
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R346

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本文編號：2535890