【摘要】： 獲得性免疫缺陷綜合征,即艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS),是由人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染引起的一種免疫缺陷性疾病。到2007年底,全球現(xiàn)有3 300多萬(wàn)人HIV感染者,2007年死于艾滋病的人數(shù)達(dá)210萬(wàn),我國(guó)現(xiàn)存HIV感染者約70萬(wàn)人,2007年死于艾滋病的人數(shù)達(dá)2萬(wàn)余。因此,艾滋病是危害我國(guó),乃至全世界的重要傳染病之一。 母嬰傳播和性傳播是HIV-1的2種重要的傳播方式,也是目前HIV-1感染迅速增長(zhǎng)的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn),HIV-1傳播受多種因素影響,如感染途徑、病毒亞型、黏膜完整性以及病毒適應(yīng)性等。其中對(duì)病毒囊膜可變區(qū)的研究最多,因?yàn)椴《灸夷さ鞍譯p120亞單位不但能夠決定病毒的細(xì)胞嗜性,而且是中和抗體的主要作用靶點(diǎn)。此外,研究HIV-1的env基因的多樣性可以在一定程度上反映整個(gè)基因組的情況。 HIV-1傳播的遺傳“瓶頸”效應(yīng)越來(lái)越受到人們關(guān)注,相關(guān)的研究也層出不窮。目前的研究結(jié)果顯示,母嬰傳播與性傳播在選擇性壓力方面存在不同的機(jī)制,中和抗體的篩選作用在母嬰傳播中較為突出,而中和抗體在性傳播中的篩選作用不明顯,完整的黏膜對(duì)性傳播的選擇起關(guān)鍵作用。HIV-1的細(xì)胞嗜性在傳播中也是重要的選擇因素,既往的研究發(fā)現(xiàn),發(fā)生傳播的絕對(duì)多數(shù)均為R5巨噬細(xì)胞嗜性的HIV-1。已知CTL在HIV-1感染中起重要作用,其發(fā)揮作用是通過(guò)與HLA限制性的CTL表位結(jié)合識(shí)別并殺傷靶細(xì)胞。CTL是否也在傳播中起選擇作用,目前尚未見(jiàn)到相關(guān)研究報(bào)道。理論上講,更換宿主后,HLA類(lèi)型不同,CTL作用表位必然不同,推測(cè)其在傳播中有一定的選擇作用。 目前發(fā)現(xiàn)的HIV-1的CTL表位有很多,幾乎所有HIV-1編碼的蛋白上均有CTL的表位。因此,HIV-1各個(gè)區(qū)域相應(yīng)位點(diǎn)的突變均可導(dǎo)致CTL表位的改變。HIV-1各個(gè)區(qū)域突變頻率不同,env區(qū)突變頻率最高,導(dǎo)致的CTL表位變化最多。 HIV-1感染后可刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)囊膜蛋白的中和抗體。艾滋病病人體內(nèi)中和抗體滴度水平明顯較無(wú)癥狀攜帶者低,說(shuō)明中和抗體有一定的保護(hù)作用。但抗體不能與單核巨噬細(xì)胞內(nèi)存留的病毒接觸,且HIV-1囊膜蛋白易發(fā)生抗原性變異,使原有中和抗體不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。此外,在潛伏感染階段,HIV前病毒整合入宿主細(xì)胞基因組中,不被免疫系統(tǒng)識(shí)別,也是逃避免疫清除的一種方式。囊膜蛋白是中和抗體的主要靶點(diǎn),其中g(shù)p120的V3區(qū)的頂端4肽是重要的免疫優(yōu)勢(shì)中和結(jié)構(gòu)域(principal neutralizing epitope, PND)。 鑒于以上理論,我們?cè)O(shè)計(jì)并實(shí)施如下研究方案:從109例HIV感染者中挑選4對(duì)母嬰傳播和8對(duì)男傳女性傳播的傳播者和感染者作為研究對(duì)象,分析傳播者和感染者體內(nèi)HIV-1準(zhǔn)種復(fù)雜度和熵值,對(duì)該區(qū)域進(jìn)行序列分析,確定病毒的細(xì)胞嗜性,尋找存在的CTL表位和中和抗體表位,探究在兩種傳播方式下,病毒準(zhǔn)種傳播的選擇性與CTL表位、中和抗體表位和細(xì)胞嗜性的變化的關(guān)系,為進(jìn)一步揭示傳播的遺傳“瓶頸”效應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 主要研究結(jié)果 1.分析并總結(jié)了1995年11月至2008年1月,確診艾滋病患者及感染HIV的配偶或/和子女共109例的流行病學(xué)和臨床資料,其中包括4對(duì)母嬰傳播病例和8對(duì)男傳女性傳播病例。流行病學(xué)分析:109例中男性有64例,女性45例,21歲～40歲間有67例,來(lái)自重慶市的有77例,性傳播感染者有64例;臨床表現(xiàn):最常見(jiàn)的3個(gè)臨床表現(xiàn)為發(fā)熱(60例)、體重減輕(46例)和腹瀉(15例);檢查結(jié)果:CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的最大值為670個(gè)/μl,最小值為2個(gè)/μl,平均值為120.35±82.83個(gè)/μl;HIV-RNA的最大值為5.222×10~7copies/ml,最小值為0 copy/ml,平均值為6.56×10~4copies/ml;治療及預(yù)后:有15例接受HAART,2例在治療過(guò)程中死亡,其余13例健在。 2.母嬰傳播病例的病毒準(zhǔn)種復(fù)雜度和熵值分析結(jié)果:4對(duì)中有3對(duì)的母親的病毒準(zhǔn)種復(fù)雜度和熵值高于其子,只有1對(duì)的母親低于其子;母嬰傳播病例的CTL表位分析結(jié)果:2對(duì)子代體內(nèi)病毒出現(xiàn)母親沒(méi)有的新表位,另外2對(duì)未出現(xiàn)新表位;中和抗體表位分析發(fā)現(xiàn):僅發(fā)現(xiàn)2個(gè)次要中和抗體表位;未發(fā)現(xiàn)含頂端4肽的主要中和表位;細(xì)胞嗜性預(yù)測(cè)結(jié)果:其中2對(duì)母子體內(nèi)的病毒均為R5型、非合胞體誘導(dǎo)型、巨噬細(xì)胞嗜性,1對(duì)為X4型、合胞體誘導(dǎo)型、T細(xì)胞嗜性,1對(duì)的母親為R5、非合胞體誘導(dǎo)型、巨噬細(xì)胞嗜性,其子為X4型、合胞體誘導(dǎo)型、T細(xì)胞嗜性。 3.性傳播病例的病毒準(zhǔn)種復(fù)雜度和熵值分析結(jié)果:8對(duì)中有4對(duì)的男性體內(nèi)病毒準(zhǔn)種復(fù)雜度和熵值高于女性,有3對(duì)的男性低于女性,1對(duì)男女相同;CTL表位分析結(jié)果:5對(duì)被傳播感染的女性出現(xiàn)了傳播者男性沒(méi)有的新表位,其余3對(duì)未出現(xiàn)新表位;中和抗體表位分析發(fā)現(xiàn):發(fā)現(xiàn)2個(gè)中和抗體表位,一個(gè)是次要中和抗體表位,另一個(gè)是主要中和抗體表位“IGPGR”,僅一例傳播者體內(nèi)病毒含此表位;細(xì)胞嗜性預(yù)測(cè)結(jié)果:其中5對(duì)均為R5型、非合胞體誘導(dǎo)型、巨噬細(xì)胞嗜性,2對(duì)為X4、合胞體誘導(dǎo)型、T細(xì)胞嗜性,1對(duì)的男性為X4型、合胞體誘導(dǎo)型、T細(xì)胞嗜性,女性為R5型、非合胞體誘導(dǎo)型、巨噬細(xì)胞嗜性。 結(jié)論 1.通過(guò)我院13年109例HIV感染者資料系統(tǒng)綜合分析提出對(duì)本地區(qū)病例的以下新認(rèn)識(shí): (1)艾滋病已經(jīng)從既往的少見(jiàn)病逐漸成為常見(jiàn)病,性傳播途徑感染比例最高,感染者以中青年為主,女性感染人數(shù)不斷增加。 (2)最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)復(fù)雜,常見(jiàn)病的表現(xiàn)不典型,少見(jiàn)病容易造成誤診或漏診。 (3)艾滋病并發(fā)癥能夠被有效控制,聯(lián)合HAART可明顯提高生活質(zhì)量和延長(zhǎng)生存時(shí)間。 2.通過(guò)四對(duì)母嬰傳播有關(guān)研究結(jié)果系統(tǒng)綜合分析有以下新發(fā)現(xiàn): (1)母親的準(zhǔn)種復(fù)雜度和熵值通常高于其子,說(shuō)明準(zhǔn)種傳播的選擇性存在。 (2)被選擇性傳播的HIV-1準(zhǔn)種可快速進(jìn)化產(chǎn)生新的CTL表位,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),產(chǎn)生的新的CTL表位的概率增高。 (3)被選擇性傳播的HIV-1準(zhǔn)種對(duì)中和抗體有抗性,且為巨噬細(xì)胞嗜性。 3.通過(guò)八對(duì)性傳播有關(guān)研究結(jié)果系統(tǒng)綜合分析有以下新發(fā)現(xiàn): (1)傳播者的準(zhǔn)種復(fù)雜度和熵值高于被傳播者,說(shuō)明準(zhǔn)種傳播的選擇性存在。 (2)被選擇性傳播的HIV-1準(zhǔn)種可快速進(jìn)化產(chǎn)生新的CTL表位。 (3)被選擇性傳播的HIV-1準(zhǔn)種為巨噬細(xì)胞嗜性。
【圖文】：

00 μl 洗液，振蕩使沉淀懸浮，13 000 rpm 離心 1 min，去上清，加使沉淀懸浮，13 000 rpm 離心 1 min，去上清，加 30 μl 洗脫液，室溫作pm 離心 1 min，吸取上清入新離心管，13 000 rpm 離心 1 min，獲得 目的 DNA 與 PCR2.1 載體連接 PCR2.1(圖 2-1)與插入的目的 DNA的物質(zhì)的量之比為 3:1，反應(yīng)體系為 14℃，12 h。 感受態(tài)大腸埃希菌的制備 000ml 錐形瓶配制 100 ml SOB 高壓蒸汽滅菌→接種環(huán)挑取 Top10 大落接種于 SOB→18℃振蕩培養(yǎng)細(xì)菌至菌液 OD≈0.6→轉(zhuǎn)移至 2 個(gè) 50 m內(nèi)，冰上孵育 10min→4℃ 3 000 g 離心 10min→每管內(nèi)加 12.8 ml 預(yù)孵育 10min→4℃ 3 000 g 離心 10min→每管內(nèi)加 3.2 ml TB+0.24 m 10min→100 μl 分裝，－70℃保存。

圖 2-2 Geno2pheno [coreceptor]輸入界面：1.Identifier 處輸入檢測(cè)樣本名稱(chēng)；2.Significance Levels 處選擇假陽(yáng)性率(特異性)，，默認(rèn)值為 10％，瀏覽處上傳序列文件；3.Sequence containing the V3 region of gp120 處輸入包含V3 區(qū)的序列；4.Additional parameters 處可以選擇性填寫(xiě)；5.Action 處點(diǎn)擊 Go，即開(kāi)始比對(duì)預(yù)結(jié) 果一、套式 PCR 產(chǎn)物于 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果套式 PCR 產(chǎn)物于 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果(圖 2-3)，M 代表 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)的 DNA 片段大小約為 762 bp。CM ZDB M YJ WYF YJR TLS DSF SODSF N762bp
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R512.91;R392

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本文編號(hào)：2535524