發(fā)布時(shí)間：2019-09-16 00:20

【摘要】： 黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的一種毒素,國(guó)際上以黃曲霉毒素的毒性作為10,000的基準(zhǔn),來(lái)比較其它物質(zhì)的毒性。黃曲霉毒素的危害性主要表現(xiàn)為強(qiáng)烈的毒性和致癌性,由于它在花生、玉米等食品中廣泛存在,因此嚴(yán)重危害了人們的身體健康。在現(xiàn)代社會(huì)里,隨著人們生活水平的提高,人們?nèi)找骊P(guān)注食品安全問(wèn)題,食品安全已引起各國(guó)政府的嚴(yán)重關(guān)注,歐盟在2000年就提出了世界上最嚴(yán)格的安全標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),其中AFB1為2μg/kg,總黃曲霉毒素為4μg/kg。因此,也形成了新貿(mào)易壁壘,對(duì)我們國(guó)家的農(nóng)產(chǎn)品出口造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。 本研究以AFB1-BSA免疫小白鼠,經(jīng)過(guò)三次免疫以后,用間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清,選取血清效價(jià)高達(dá)16000的小鼠,在四免后取效價(jià)最高的小鼠的脾臟細(xì)胞,利用50%PEG4000將其與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合,制備雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)過(guò)對(duì)培養(yǎng)上清的篩選和雜交瘤細(xì)胞的克隆化,最終得到能分泌黃曲霉毒素B1抗體的雜交瘤細(xì)胞株0G9。再將單克隆雜交瘤細(xì)胞系提取RNA,經(jīng)過(guò)RT-PCR獲得抗體可變區(qū)基因,利用一柔性肽段(Linker)連接形成單鏈抗體(single chain fragments variable,scFv),后應(yīng)用基因工程方法,將scFv與噬菌粒載體pCANTAB-5E連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG_1,獲得單鏈抗體噬菌體文庫(kù)和利用噬菌體展示(Phage display)技術(shù)對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行了4輪淘選(panning),獲得了AFB1特異性的單鏈抗體,為進(jìn)一步的抗體工程奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

此不需要通過(guò)提純總RNA制備mRNA。用合成的cDNA做模板，使用在前面列出的對(duì)應(yīng)的通用引物，分別擴(kuò)增出重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)vL。然后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。擴(kuò)增結(jié)果如圖3一3所示，其中重鏈Vl、大約是340如，輕鏈vL大約是325bp，與理論值相符。3.4.3:cFv基因的擴(kuò)增與組裝本試驗(yàn)通過(guò)一條靈活的多膚連Linke:將重鏈VH與輕鏈VL連接起來(lái)組裝成ScFv基因。在PcR體系中，通過(guò)重疊延伸拼接反應(yīng)(SOE)，組裝成VH一Linker一VL或者VL一Linker一vH。然后以此作為模板，加入上游與下游帶有酶切位點(diǎn)的對(duì)應(yīng)的引物，特異性進(jìn)行擴(kuò)增scFv基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，試驗(yàn)結(jié)果如圖3一4

3.4.4pQYI.s質(zhì)粒雙酶切pQYI.5質(zhì)粒經(jīng)Notl和胡I雙酶切后，切掉750bP大小的片段，膠回收大片段，得到載體 pCANTABSE，然后與雙酶切后的scFv進(jìn)行連接(如圖3一5)。3.4.5噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建及噬菌體展示將切膠回收得到的scFv用動(dòng)I和Notl酶切，，由于動(dòng)I和Notl酶切條件不一致，故分開(kāi)來(lái)切。先50℃用動(dòng)I酶切4h，酶滅活后再用 Not137℃酶切4h，最后乙醇沉淀回收。定量后與同樣雙酶切的載體pCANTABSE以摩爾比3:1的比例16℃連接過(guò)夜。為了擴(kuò)大庫(kù)容，連接10管，每管20林L體系，連接過(guò)夜后用乙醇沉淀，再溶于總體積10~20兩的超純水中。其載體構(gòu)建如圖3一6。圖3一5質(zhì)粒pQYI.5雙酶切圖Fig3一 5ThedoubledigestionofPQYI.51
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 才琳;抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體和單鏈抗體的制備及活性研究[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2010年

2 王瑩;同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素的生物芯片技術(shù)研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2536012