發(fā)布時間：2019-09-12 21:36

【摘要】：乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV),又稱日本腦炎病毒。屬于黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬,日本腦炎病毒廣泛分布于亞洲南部和東南地區(qū),其中包括中國、印度、日本等地。主要通過蚊子傳播致使人發(fā)生急性腦炎,其致死率從20%到50%,并且絕大多數(shù)的幸存者都具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的后遺癥。豬流行性乙型腦炎與人流行性乙型腦炎密切相關(guān)。因此,預防豬感染本病是防止人患乙腦的重要措施。穩(wěn)定、安全以及新型的乙腦疫苗已經(jīng)成為近年乙腦感染防治的主要研究方向。近年來,隨著分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展,乙型腦炎基因工程疫苗等多種新型的疫苗都在不斷的研究開發(fā)中。疫苗在保護機體免受病毒感染中起到重要作用Prime-boost (DNA初免和蛋白加強)免疫的方法是通過DNA編碼病毒目的蛋白進行首次免疫,再用此體外表達的蛋白進行加強免疫的策略。通過DNA初免和蛋白加強免疫的策略,我們對日本腦炎病毒NS1蛋白的效力進行了研究。本研究主要從以下幾個方面展開。 1.合成日本腦炎病毒NS1蛋白,在此基礎(chǔ)上將其插入真核表達質(zhì)粒pCDNA3.0中,構(gòu)建重組真核質(zhì)粒pcDNA-NS1。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細胞,利用間接免疫熒光證明pcDNA-NS1在真核細胞內(nèi)能有效的轉(zhuǎn)錄和表達；Western-blot檢測表明重組真核質(zhì)粒的表達產(chǎn)物能與JEV陽性血清特異性結(jié)合,證明其具有一定的生物學活性和抗原性。 2.擴增NS1基因片段,將其克隆至原核表達載體pET-28a(+),命名為pET-rNSl.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli) BL21(DE3)感受態(tài)細胞,酶切鑒定的陽性菌經(jīng)1mMIPTG誘導表達4h后,將大腸桿菌以6000 rpm離心10min,用PBS洗兩次,收集細菌,將其懸浮在PBS中,進行超聲波破碎,以10000 rpm離心20min,將上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果表明這種蛋白以包涵體形式存在。將包涵體在8M的尿素中過夜溶解,然后將上清過柱對重組表達產(chǎn)物進行純化。結(jié)果顯示融合蛋白的分子量為40kDa, Western blot表明重組蛋白具有抗JEV的特異抗原性。 3.利用新型的免疫策略,為了評價構(gòu)建的DNA疫苗和重組蛋白疫苗的免疫效力,將4周齡Ba1b/c小鼠隨機分成5組,設(shè)rNS1(Ⅰ), pcDNA-NS1(Ⅱ), pcDNA-NS1+rNS1(Ⅲ),弱毒疫苗(Ⅳ), pcDNA3.0空載體對照組(V)。肌肉注射免疫,重組質(zhì)粒的免疫劑量為50μg/只,重組蛋白的免疫劑量為200 pmo1/只,弱毒苗免疫組按照使用說明進行。利用商品化的ELISA試劑盒檢測免疫小鼠脾臟淋巴細胞分泌IFN-γ和IL-4的能力,并與弱毒苗進行比較。同時進行攻毒保護性試驗,利用微量中和試驗檢測免疫攻毒后的中和抗體。結(jié)果表明,新型的疫苗策略能誘導產(chǎn)生針對JEV的特異性體液免疫和細胞免疫應答。弱毒苗免疫組產(chǎn)生了最高的中和抗體,其次由高到低依次為,pcDNA-NS1+rNS1, rNSl, pcDNA-NS1.通過對抗體亞型及細胞因子的測定,rNSl主要是增強Th2免疫反應,pcDNA-NS1和弱毒苗免疫組增強Thl免疫反應,而pcDNA-NS1+ rNS1則產(chǎn)生Th1/Th2 (?)昆合型的免疫反應。pcDNA-NS1+rNS1免疫組具有較高的免疫保護作用。這為研究能夠更好地預防JEV感染的新型疫苗提供新的思路。 總之,新型prime-boost(DNA初免蛋白加強)免疫策略能有效提高抗體水平,以及T、B細胞的免疫反應,對乙型腦炎的感染能起到很好的免疫保護作用。
【圖文】：

文獻綜述第一章乙型腦炎的砂「究進展心.其包膜中有糖基化蛋白E和糖基化蛋白M。沉降系數(shù)2005，分子量為4.2X106道爾頓.其基因組為正鏈單股RNA病毒，基因組長度11knt(IO976nt)，80年代中期以來，先后對乙腦病毒JaOArS982株、Nakayama株、Bejing一工株和SA一14及減毒株SA一14一14一2進行了序列測定和分析，證明JEV基因結(jié)構(gòu)與其它黃病毒相類似。乙腦病毒基因RNA全長為10976個nt，5’端95個nt和3’端585個flt為非編碼區(qū)，從5’端第96位ATG起始，至3’端第10393位終止，形成一個長為10296個nt的開放讀碼框架(ORF)，也僅含有一個ORF，它編碼一個全長為3432個AA的多蛋白前體〔劉。從5’末端至3’束端的編碼順序如(圖1)所示。

圖2.RXA病毒結(jié)構(gòu)，S宜RXA目標位點F主9.2Sch娜atier叩化s巴irationsoftarget訪r肚R入Astru改uresiRNAtargers工tes4乙型腦炎檢測技術(shù)研究進展4.1血清學檢測傳統(tǒng)的血清學方法有血凝抑制試驗(H工)、補體結(jié)合試驗(CT)、中和試驗(NT)等。目前主要應用的有酶聯(lián)免疫吸附試驗(EL工SA)，分子勃附試驗(PAA)，免疫熒光法(工FA)。4.1.1血凝抑制試驗(Hl)[32〕該法是流行病學調(diào)查和臨床診斷中最常用的方法，被檢血清即使有些污染，經(jīng)高嶺土處理后均可用于試驗。乙腦H工抗體出現(xiàn)較早，一般在病后4一5天開始出現(xiàn)，2周左右達到高峰，并可維持1天左右。因此測定HI抗體可用于早期診斷。4.1.2補體結(jié)合試驗(eT)[，，]
【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：2535356