【摘要】：乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV),又稱日本腦炎病毒。屬于黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬,日本腦炎病毒廣泛分布于亞洲南部和東南地區(qū),其中包括中國(guó)、印度、日本等地。主要通過(guò)蚊子傳播致使人發(fā)生急性腦炎,其致死率從20%到50%,并且絕大多數(shù)的幸存者都具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的后遺癥。豬流行性乙型腦炎與人流行性乙型腦炎密切相關(guān)。因此,預(yù)防豬感染本病是防止人患乙腦的重要措施。穩(wěn)定、安全以及新型的乙腦疫苗已經(jīng)成為近年乙腦感染防治的主要研究方向。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,乙型腦炎基因工程疫苗等多種新型的疫苗都在不斷的研究開(kāi)發(fā)中。疫苗在保護(hù)機(jī)體免受病毒感染中起到重要作用Prime-boost (DNA初免和蛋白加強(qiáng))免疫的方法是通過(guò)DNA編碼病毒目的蛋白進(jìn)行首次免疫,再用此體外表達(dá)的蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫的策略。通過(guò)DNA初免和蛋白加強(qiáng)免疫的策略,我們對(duì)日本腦炎病毒NS1蛋白的效力進(jìn)行了研究。本研究主要從以下幾個(gè)方面展開(kāi)。 1.合成日本腦炎病毒NS1蛋白,在此基礎(chǔ)上將其插入真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.0中,構(gòu)建重組真核質(zhì)粒pcDNA-NS1。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,利用間接免疫熒光證明pcDNA-NS1在真核細(xì)胞內(nèi)能有效的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；Western-blot檢測(cè)表明重組真核質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物能與JEV陽(yáng)性血清特異性結(jié)合,證明其具有一定的生物學(xué)活性和抗原性。 2.擴(kuò)增NS1基因片段,將其克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+),命名為pET-rNSl.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli) BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,酶切鑒定的陽(yáng)性菌經(jīng)1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h后,將大腸桿菌以6000 rpm離心10min,用PBS洗兩次,收集細(xì)菌,將其懸浮在PBS中,進(jìn)行超聲波破碎,以10000 rpm離心20min,將上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果表明這種蛋白以包涵體形式存在。將包涵體在8M的尿素中過(guò)夜溶解,然后將上清過(guò)柱對(duì)重組表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。結(jié)果顯示融合蛋白的分子量為40kDa, Western blot表明重組蛋白具有抗JEV的特異抗原性。 3.利用新型的免疫策略,為了評(píng)價(jià)構(gòu)建的DNA疫苗和重組蛋白疫苗的免疫效力,將4周齡Ba1b/c小鼠隨機(jī)分成5組,設(shè)rNS1(Ⅰ), pcDNA-NS1(Ⅱ), pcDNA-NS1+rNS1(Ⅲ),弱毒疫苗(Ⅳ), pcDNA3.0空載體對(duì)照組(V)。肌肉注射免疫,重組質(zhì)粒的免疫劑量為50μg/只,重組蛋白的免疫劑量為200 pmo1/只,弱毒苗免疫組按照使用說(shuō)明進(jìn)行。利用商品化的ELISA試劑盒檢測(cè)免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-4的能力,并與弱毒苗進(jìn)行比較。同時(shí)進(jìn)行攻毒保護(hù)性試驗(yàn),利用微量中和試驗(yàn)檢測(cè)免疫攻毒后的中和抗體。結(jié)果表明,新型的疫苗策略能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)JEV的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。弱毒苗免疫組產(chǎn)生了最高的中和抗體,其次由高到低依次為,pcDNA-NS1+rNS1, rNSl, pcDNA-NS1.通過(guò)對(duì)抗體亞型及細(xì)胞因子的測(cè)定,rNSl主要是增強(qiáng)Th2免疫反應(yīng),pcDNA-NS1和弱毒苗免疫組增強(qiáng)Thl免疫反應(yīng),而pcDNA-NS1+ rNS1則產(chǎn)生Th1/Th2 (?)昆合型的免疫反應(yīng)。pcDNA-NS1+rNS1免疫組具有較高的免疫保護(hù)作用。這為研究能夠更好地預(yù)防JEV感染的新型疫苗提供新的思路。 總之,新型prime-boost(DNA初免蛋白加強(qiáng))免疫策略能有效提高抗體水平,以及T、B細(xì)胞的免疫反應(yīng),對(duì)乙型腦炎的感染能起到很好的免疫保護(hù)作用。
【圖文】：

文獻(xiàn)綜述第一章乙型腦炎的砂「究進(jìn)展心.其包膜中有糖基化蛋白E和糖基化蛋白M。沉降系數(shù)2005，分子量為4.2X106道爾頓.其基因組為正鏈單股RNA病毒，基因組長(zhǎng)度11knt(IO976nt)，80年代中期以來(lái)，先后對(duì)乙腦病毒JaOArS982株、Nakayama株、Bejing一工株和SA一14及減毒株SA一14一14一2進(jìn)行了序列測(cè)定和分析，證明JEV基因結(jié)構(gòu)與其它黃病毒相類似。乙腦病毒基因RNA全長(zhǎng)為10976個(gè)nt，5’端95個(gè)nt和3’端585個(gè)flt為非編碼區(qū)，從5’端第96位ATG起始，至3’端第10393位終止，形成一個(gè)長(zhǎng)為10296個(gè)nt的開(kāi)放讀碼框架(ORF)，也僅含有一個(gè)ORF，它編碼一個(gè)全長(zhǎng)為3432個(gè)AA的多蛋白前體〔劉。從5’末端至3’束端的編碼順序如(圖1)所示。

圖2.RXA病毒結(jié)構(gòu)，S宜RXA目標(biāo)位點(diǎn)F主9.2Sch娜atier叩化s巴irationsoftarget訪r肚R入Astru改uresiRNAtargers工tes4乙型腦炎檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展4.1血清學(xué)檢測(cè)傳統(tǒng)的血清學(xué)方法有血凝抑制試驗(yàn)(H工)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CT)、中和試驗(yàn)(NT)等。目前主要應(yīng)用的有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(EL工SA)，分子勃附試驗(yàn)(PAA)，免疫熒光法(工FA)。4.1.1血凝抑制試驗(yàn)(Hl)[32〕該法是流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷中最常用的方法，被檢血清即使有些污染，經(jīng)高嶺土處理后均可用于試驗(yàn)。乙腦H工抗體出現(xiàn)較早，一般在病后4一5天開(kāi)始出現(xiàn)，2周左右達(dá)到高峰，并可維持1天左右。因此測(cè)定HI抗體可用于早期診斷。4.1.2補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(eT)[，，]
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2535356