【摘要】： 冠狀病毒可引起人和動物的多種疾病,其中人類冠狀病毒可引起10%-30%的普通感冒,亦可引起如SARS等嚴(yán)重傳染病。我國是冠狀病毒的主要分布地之一,因此開展冠狀病毒致病機(jī)制的研究對于提高我國應(yīng)對此類疾病的防控能力具有重要意義。 但目前出于生物安全方面的考慮,針對SARS-CoV致病機(jī)制的研究受到了嚴(yán)重的制約。在這種情況下,與SARS親緣關(guān)系較近的鼠肝炎冠狀病毒(Mouse Hepatitis Virus,MHV)便成為較為理想的研究對象。這是因?yàn)?第一,鼠肝炎冠狀病毒(Mouse Hepatitis Virus,MHV)與SARS冠狀病毒(SARS-CoV)同屬于Ⅱ組冠狀病毒,兩者的親緣關(guān)系較近;第二,MHV是Ⅱ組冠狀病毒的代表株,它具有良好的動物模型;第三,MHV對人不致病,易于開展實(shí)驗(yàn)研究,其研究成果對人類疾病也更具有指導(dǎo)意義。 研究表明,MHV和SARS-CoV的非結(jié)構(gòu)蛋白1(Non-Structural Protein 1,NSP1)具有抑制宿主抗病毒反應(yīng)的功能,是冠狀病毒的重要致病因子。并且通過配對分析發(fā)現(xiàn),在MHV和SARS-CoV NSP1中存在著一段高度保守的氨基酸序列-LLRKxGxKG。該序列可能是NSP1的重要功能域,與MHV NSP1和SARS-CoV NSP1共同具有的某些功能有關(guān)。這值得我們進(jìn)行深入的研究。 因此,本研究以MHV為研究模式株,從Ⅱ組冠狀病毒MHV與SARS-CoV NSP1內(nèi)高度保守的氨基酸序列-LLRKxGxKG入手,對該保守序列進(jìn)行缺失突變,分別構(gòu)建了MHV NSP1突變基因及MHV突變體。通過檢測LLRKxGxKG序列缺失前后NSP1蛋白的功能變化,并分析MHV突變體的復(fù)制能力,以及對小鼠的致病力和組織嗜性等方面的變化,從分子、細(xì)胞和動物三級水平上揭示Ⅱ組冠狀病毒NSP1及其保守序列LLRKxGxKG的功能。以期加深我們對SARS-CoV等Ⅱ組冠狀病毒致病機(jī)制的了解,并為抗病毒藥物的設(shè)計(jì)和新型減毒疫苗的研制提供參考。 一、鼠肝炎冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1及其保守序列LLRKxGxKG的體外功能研究 首先,我們分別構(gòu)建了MHV NSP1的真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-NSP1)及LLRKxGxKG序列缺失的突變NSP1真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-NSP1-mu)。為檢測MHV NSP1對IFN-β生成的影響,我們分別用pcDNA3.1-NSP1和pcDNA3.1-NSP1-mu轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞,利用新城疫病毒(new-castle disease virus,NDV)刺激誘導(dǎo)后,檢測細(xì)胞上清中IFN-β的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,瞬時表達(dá)MHV NSP1或缺失突變NSP1分別使IFN-β的表達(dá)水平下降了12.8%和18.4%,兩者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明MHV NSP1對IFN-β的生成具有一定的抑制作用,但LLRKxGxKG序列與此功能無關(guān)。 為進(jìn)一步分析MHV NSP1對IFN-β信號通路的影響,我們用報告質(zhì)粒(-110- IFNβ)-CAT和ISRE-Luc分別與真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-NSP1或pcDNA3.1-NSP1-mu進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。通過檢測CAT和Luc報告基因表達(dá)水平,分析MHV NSP1及保守序列LLRKxGxKG對IFN-β啟動子和IFN刺激應(yīng)答元件活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在進(jìn)行刺激誘導(dǎo)的情況下,與空載體對照組相比,pcDNA3.1-NSP1和pcDNA3.1-NSP1-mu轉(zhuǎn)染組的報告基因表達(dá)水平均顯著下降(P0.01),且兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。這表明,MHV NSP1可顯著抑制IFN-β啟動子和IFN刺激應(yīng)答元件的活性,并且該抑制作用不受LLRKxGxKG序列缺失的影響。 上述實(shí)驗(yàn)中我們偶然發(fā)現(xiàn),在不進(jìn)行刺激誘導(dǎo)的情況下,LLRKxGxKG序列缺失前后MHV NSP1對報告基因的抑制作用有顯著變化。根據(jù)文獻(xiàn)報道,SARS-CoV NSP1具有抑制宿主基因表達(dá)的功能。為檢驗(yàn)MHV NSP1是否具有相同功能,我們另外選擇了三種報告質(zhì)粒(pRLuc-CMV、pGL3-basic和pGL3-control)分別與pcDNA3.1-NSP1或pcDNA3.1-NSP1-mu共轉(zhuǎn)染,并檢測報告基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空載體對照組相比,pcDNA3.1-NSP1和pcDNA3.1-NSP1-mu轉(zhuǎn)染組的報告基因表達(dá)水平均顯著下降(P0.01),但當(dāng)LLRKxGxKG序列缺失后,該抑制作用顯著降低(P0.01)。該結(jié)果表明,MHV NSP1具有抑制共轉(zhuǎn)染基因表達(dá)的功能,LLRKxGxKG序列在此過程中發(fā)揮重要作用。這提示我們,LLRKxGxKG序列是MHV NSP1的重要功能域,它對宿主基因的表達(dá)可能具有同樣的抑制作用,值得進(jìn)行深入研究。 二、LLRKxGxKG序列缺失的鼠肝炎冠狀病毒突變體的拯救 為深入了解MHV NSP1內(nèi)保守序列LLRKxGxKG與病毒致病性的關(guān)系,我們利用以痘苗病毒為載體的MHV反向遺傳學(xué)系統(tǒng),構(gòu)建了LLRKxGxKG序列缺失的MHV突變體,以便對LLRKxGxKG序列的功能進(jìn)行研究。 首先,利用含鼠肝炎冠狀病毒基因組全長cDNA的重組痘苗病毒(Vaccinia Virus-inf-1(V.V.-inf-1)介導(dǎo)的同源重組,以大腸桿菌gpt(guanine-phosphoribosyl transferase)基因作為雙向篩選標(biāo)記,通過GPT-in和GPT-out兩輪重組,用NSP1突變基因替換掉原MHV基因組的NSP1基因,經(jīng)過篩選、純化,獲得含突變MHV基因組的重組痘苗病毒(V.V.-MHV-NSP1 mu)。然后,擴(kuò)增V.V.-MHV-NSP1 mu并提取病毒DNA,經(jīng)酶切獲得突變的MHV基因組全長cDNA,并以此為模板通過體外轉(zhuǎn)錄,得到突變的MHV基因組全長RNA,進(jìn)而轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。經(jīng)對轉(zhuǎn)染后得到重組MHV的鑒定,證明成功地拯救到了LLRKxGxKG序列缺失的MHV突變體,命名為MHV-NSP1"，

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