【摘要】： 目的:設(shè)計(jì)和構(gòu)建針對(duì)HER3基因mRNA的特異性RNA干擾質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞株,研究此細(xì)胞株中HER3的RNA干擾抑制效率,以及HER3表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞株生長(zhǎng)增殖的影響,初步探討RNA干擾技術(shù)防治乳腺癌的可行性。 方法:設(shè)計(jì)兩個(gè)shRNA序列,構(gòu)建了兩組針對(duì)HER3基因mRNA的可以穩(wěn)定遺傳的特異性RNAi-Ready-pSIREN-RetroQ-TetP-HER3的重組質(zhì)粒(簡(jiǎn)稱:RNAi-HER3質(zhì)粒)。轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞株,進(jìn)行體外研究。用RT-PCR、Western Blotting和流式細(xì)胞術(shù)分別在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)重組質(zhì)粒對(duì)乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞株HER3基因表達(dá)的抑制作用,MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,并觀察轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 結(jié)果:(1). DNA測(cè)序結(jié)果顯示,構(gòu)建的2個(gè)重組質(zhì)粒(依據(jù)設(shè)計(jì)shRNA序列的位點(diǎn)命名為RNAi-HER3-131、RNAi-HER3-326)符合試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。(2). RT-PCR技術(shù)檢測(cè),RNAi-HER3-131轉(zhuǎn)染24小時(shí)后HER3mRNA表達(dá)量明顯低于對(duì)照組,有明顯的干擾作用;而RNAi-HER3-326轉(zhuǎn)染24小時(shí)后HER3mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化,提示RNAi-HER3-326干擾作用不明顯。(3). Western Blotting技術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),RNAi-HER3-131轉(zhuǎn)染MDA-MB-453細(xì)胞24小時(shí)后HER3的蛋白表達(dá)明顯受抑;RNAi-HER3-326轉(zhuǎn)染細(xì)胞與對(duì)照組相比蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。(4). MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率,RNAi-HER3-131轉(zhuǎn)染24小時(shí)后存活率顯著低于對(duì)照組和RNAi-HER3-326轉(zhuǎn)染組(P0.01),而空載體轉(zhuǎn)染組和RNAi-HER3-326轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比,存活率無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 結(jié)論:轉(zhuǎn)染及RNA干擾技術(shù)建立的HER3表達(dá)抑制細(xì)胞可以成為簡(jiǎn)單實(shí)用的細(xì)胞模型;HER3-siRNA抑制HER3的表達(dá)后可在體外抑制MDA-MB-453細(xì)胞的存活。
【圖文】：

同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 倒置顯微鏡(日本 Nikon)垂直 SDS-PAGE 電泳系統(tǒng)（美國(guó) BIORAD）全自動(dòng) X 光片洗相系統(tǒng)（美國(guó) KODAK）FACalibration(美國(guó) BD 公司)iRNA 真核表達(dá)載體的構(gòu)建

EcoRI 酶切黏末端的正、反寡核苷酸鏈，，然后退火成雙鏈DNA，插入RNAi表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，經(jīng)氨芐青霉素篩選得到陽(yáng)性克隆，用通用引物U6對(duì)之進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果如圖2a和圖3a所示，在有效測(cè)定區(qū)，其測(cè)量峰明顯，雜峰很小，表明其準(zhǔn)確度較高。比對(duì)結(jié)果提示克隆的HER3-RNAi-131和HER3-RNAi-326的序列準(zhǔn)確無(wú)誤（圖2b，圖3b）。圖 2a HER3-RNAi-131 測(cè)序圖
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 胡偉國(guó);Her-2的研究進(jìn)展與乳腺癌[J];腫瘤學(xué)雜志;2002年06期

本文編號(hào)：2534366