【摘要】： 次級淋巴樣組織趨化因子(secondary lymphoid tissue chemokine,SLC)最早發(fā)現(xiàn)是一種T細胞特異性趨化因子,對NK細胞和成熟的DC也具有一定的趨化作用。T、NK細胞和DC在機體抗腫瘤免疫中重要的作用。研究表明,缺乏鼠SLC的小鼠T細胞歸巢和DC定位發(fā)生障礙,次級淋巴組織結構功能紊亂。近期研究發(fā)現(xiàn),SLC受體CCR7表達于初始T細胞、B細胞、DC細胞及黑色素瘤細胞,乳腺癌細胞等多種惡性腫瘤細胞表面,淋巴結部位SLC與其受體CCR7的結合,可促使細胞向淋巴結等次極細胞組織移動,與淋巴細胞歸巢有關。因此,SLC及其受體極富潛力成為自身免疫性疾病、移植排斥反應及腫瘤藥物設計的新型靶點。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),一定濃度梯度的標準SLC蛋白能夠抑制腫瘤生長,并且能夠促進外周血淋巴細胞有一定程度的增殖。 【目的】據(jù)此,本實驗采用基因工程技術,構建人SLC真核表達載體,轉染MCF-7細胞,檢測SLC在細胞中的表達,隨后檢測其對轉染細胞的作用及對PBMC的影響,為進一步研究SLC的作用機制及相關疾病應用研究奠定基礎。 【方法】 1.人SLC真核表達載體的構建與表達 (1)人SLC基因表達載體的構建及測序 以本室已有SLC-RFP為模板,體外PCR擴增基因SLC片斷,質粒pgenesil-8、SLC回收產(chǎn)物雙酶切后,回收片斷進行連接,獲得質粒pgenesil-8-SLC,經(jīng)酶切鑒定及測序分析證實,所克隆和構建的SLC cDNA閱讀框及連接部位序列正確; (2)人SLC真核表達載體轉染MCF-7及其表達 質粒轉染乳腺癌細胞MCF-7,24小時后通過倒置熒光顯微鏡可觀察到細胞內有綠色熒光表達;western blot檢測轉染細胞24-72小時的培養(yǎng)上清。結果表明,SLC-GFP以分泌型形式表達,并在轉染后72小時達到高峰; 2.轉染SLC對MCF-7細胞凋亡的影響 實驗分組 1)空白組:MCF-7 2)轉染空載pgenesil8-GFP的MCF-7對照組:MCF-7-vector 3)轉染SLC的MCF-7實驗組:MCF-7-SLC 采用流式細胞術檢測轉染的SLC對腫瘤細胞凋亡作用,結果表明轉染SLC的MCF-7細胞與未轉染SLC及轉染空載的MCF-7相比,能顯著促進轉染細胞的凋亡。 3.轉染SLC的MCF-7對PBMC增殖作用 實驗分組 1)空白對照組:PBMC以培養(yǎng)基刺激 2)MCF-7刺激組:未轉染質粒的MCF-7刺激PBMC 3)MCF-7-vector:轉染空載體的MCF-7刺激PBMC 4)MCF-7-SLC:轉染SLC的MCF-7刺激PBMC 以正常人外周血單個核細胞(PBMC)為反應細胞,以經(jīng)絲裂霉素C處理的MCF-7、轉染空載體的MCF-7及轉染SLC的MCF-7作為刺激細胞,不同的刺激細胞分別與PBMC以1:5比例混合培養(yǎng)5天后流式細胞儀檢測,結果表明MCF-7-SLC能促進PBMC的增殖。 【結論】成功構建pgenesil8-slc-GFP真核表達載體,并證明SLC促進轉染細胞凋亡,轉染后的MCF-7能刺激PBMC增殖。
【圖文】：

14kD標準SLC 濃縮SLC 濃縮SLC圖1－2 培養(yǎng)上清中SLC的表達2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM 1 2圖1－1 重組質粒pgenesil-8-slc雙酶切鑒定M： DL2000 Marker：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp1： pGenesil-8-SLC BglII+EcoRI2: pGenesil-8-SLC BglII+EcoRI430bp13

轉染SLC的MCF-7誘導PBMC的增殖
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392.1

【參考文獻】

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1 吳砂;袁曉梅;朱慧芬;沈關心;;次級淋巴組織趨化因子濃度梯度抑制腫瘤細胞免疫逃逸[J];基礎醫(yī)學與臨床;2007年08期

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本文編號：2534093