發(fā)布時(shí)間：2019-09-10 15:05

【摘要】： 次級(jí)淋巴樣組織趨化因子(secondary lymphoid tissue chemokine,SLC)最早發(fā)現(xiàn)是一種T細(xì)胞特異性趨化因子,對(duì)NK細(xì)胞和成熟的DC也具有一定的趨化作用。T、NK細(xì)胞和DC在機(jī)體抗腫瘤免疫中重要的作用。研究表明,缺乏鼠SLC的小鼠T細(xì)胞歸巢和DC定位發(fā)生障礙,次級(jí)淋巴組織結(jié)構(gòu)功能紊亂。近期研究發(fā)現(xiàn),SLC受體CCR7表達(dá)于初始T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞,乳腺癌細(xì)胞等多種惡性腫瘤細(xì)胞表面,淋巴結(jié)部位SLC與其受體CCR7的結(jié)合,可促使細(xì)胞向淋巴結(jié)等次極細(xì)胞組織移動(dòng),與淋巴細(xì)胞歸巢有關(guān)。因此,SLC及其受體極富潛力成為自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)及腫瘤藥物設(shè)計(jì)的新型靶點(diǎn)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),一定濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)SLC蛋白能夠抑制腫瘤生長(zhǎng),并且能夠促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞有一定程度的增殖。 【目的】據(jù)此,本實(shí)驗(yàn)采用基因工程技術(shù),構(gòu)建人SLC真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,檢測(cè)SLC在細(xì)胞中的表達(dá),隨后檢測(cè)其對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的作用及對(duì)PBMC的影響,為進(jìn)一步研究SLC的作用機(jī)制及相關(guān)疾病應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。 【方法】 1.人SLC真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá) (1)人SLC基因表達(dá)載體的構(gòu)建及測(cè)序 以本室已有SLC-RFP為模板,體外PCR擴(kuò)增基因SLC片斷,質(zhì)粒pgenesil-8、SLC回收產(chǎn)物雙酶切后,回收片斷進(jìn)行連接,獲得質(zhì)粒pgenesil-8-SLC,經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序分析證實(shí),所克隆和構(gòu)建的SLC cDNA閱讀框及連接部位序列正確; (2)人SLC真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MCF-7及其表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7,24小時(shí)后通過倒置熒光顯微鏡可觀察到細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光表達(dá);western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞24-72小時(shí)的培養(yǎng)上清。結(jié)果表明,SLC-GFP以分泌型形式表達(dá),并在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)達(dá)到高峰; 2.轉(zhuǎn)染SLC對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)分組 1)空白組:MCF-7 2)轉(zhuǎn)染空載pgenesil8-GFP的MCF-7對(duì)照組:MCF-7-vector 3)轉(zhuǎn)染SLC的MCF-7實(shí)驗(yàn)組:MCF-7-SLC 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染的SLC對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡作用,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染SLC的MCF-7細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染SLC及轉(zhuǎn)染空載的MCF-7相比,能顯著促進(jìn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡。 3.轉(zhuǎn)染SLC的MCF-7對(duì)PBMC增殖作用 實(shí)驗(yàn)分組 1)空白對(duì)照組:PBMC以培養(yǎng)基刺激 2)MCF-7刺激組:未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MCF-7刺激PBMC 3)MCF-7-vector:轉(zhuǎn)染空載體的MCF-7刺激PBMC 4)MCF-7-SLC:轉(zhuǎn)染SLC的MCF-7刺激PBMC 以正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)為反應(yīng)細(xì)胞,以經(jīng)絲裂霉素C處理的MCF-7、轉(zhuǎn)染空載體的MCF-7及轉(zhuǎn)染SLC的MCF-7作為刺激細(xì)胞,不同的刺激細(xì)胞分別與PBMC以1:5比例混合培養(yǎng)5天后流式細(xì)胞儀檢測(cè),結(jié)果表明MCF-7-SLC能促進(jìn)PBMC的增殖。 【結(jié)論】成功構(gòu)建pgenesil8-slc-GFP真核表達(dá)載體,并證明SLC促進(jìn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡,轉(zhuǎn)染后的MCF-7能刺激PBMC增殖。
【圖文】：

14kD標(biāo)準(zhǔn)SLC 濃縮SLC 濃縮SLC圖1－2 培養(yǎng)上清中SLC的表達(dá)2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM 1 2圖1－1 重組質(zhì)粒pgenesil-8-slc雙酶切鑒定M： DL2000 Marker：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp1： pGenesil-8-SLC BglII+EcoRI2: pGenesil-8-SLC BglII+EcoRI430bp13

轉(zhuǎn)染SLC的MCF-7誘導(dǎo)PBMC的增殖
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 吳砂;袁曉梅;朱慧芬;沈關(guān)心;;次級(jí)淋巴組織趨化因子濃度梯度抑制腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2007年08期

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本文編號(hào)：2534093