【摘要】： 目的： 人巨細(xì)胞病毒(HCMV)UL23基因,屬病毒US22基因家族成員,編碼病毒的皮層蛋白pUL23。目前pUL23蛋白的功能尚不清楚。 我課題組通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選了與人巨細(xì)胞病毒蛋白pUL23相互作用的宿主蛋白,其中IFP35蛋白是干擾素誘導(dǎo)蛋白。病毒感染過(guò)程會(huì)引起宿主免疫系統(tǒng)的反應(yīng),包括干擾素的反應(yīng),病毒蛋白pUL23與干擾素誘導(dǎo)蛋白IFP35的相互作用,可能與病毒激起宿主的免疫反應(yīng)有關(guān)。為確定病毒蛋白pUL23是否與細(xì)胞干擾素途徑相關(guān),本課題通過(guò)GSTpull-down、免疫共沉淀及共定位等技術(shù)進(jìn)一步確認(rèn)pUL23與IFP35蛋白之間的相互作用,鑒定pUL23與IFP35相互作用蛋白結(jié)構(gòu)域,以及pUL23與IFP35相互作用的生物學(xué)效應(yīng)。研究成果將為揭示病毒蛋白pUL23的功能奠定基礎(chǔ)。方法： 1)pUL23與IFP35相互作用的確認(rèn)：①酵母雙雜交試驗(yàn)：將全長(zhǎng)的UL23與IFP35分別構(gòu)建于pGBKT7及pGADT7載體之上,利用酵母雙雜交系統(tǒng)確定此兩個(gè)蛋白的相互作用；②GST pull-down試驗(yàn)：構(gòu)建pGEX-4T-1-IFP35載體并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株Tuner(DE3)placI中表達(dá)純化GST-IFP35蛋白,同時(shí)將pCDNA3.1(-)-HA-UL23載體轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞,表達(dá)HA-UL23融合蛋白,將此兩個(gè)蛋白共孵化后,用HA抗體進(jìn)行Westenblotting檢測(cè)；③免疫共沉淀試驗(yàn)(Co-IP)：構(gòu)建pcDNA3.1(+)-IFP35-Flag載體,將其與pcDNA3.1(-)-HA-UL23共轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞,分別用HA抗體和Flag抗體進(jìn)行Westen blotting檢測(cè)；④細(xì)胞共定位試驗(yàn)：構(gòu)建pEGFP-N1-UL23和pDsRed2-C1-IFP35,將其共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞中,采用激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。 2)pUL23與IFP35相互作用結(jié)構(gòu)域的鑒定：將27個(gè)不同長(zhǎng)度的UL23短片斷分別構(gòu)建于pGBKT7及pGADT7載體之上,利用酵母雙雜交系統(tǒng)來(lái)確定pUL23與蛋白相互作用的區(qū)域。緊接著將7個(gè)不同長(zhǎng)度的IFP35短片斷分別構(gòu)建于pGBKT7及pGADT7載體之上,利用酵母雙雜交系統(tǒng)來(lái)確定IFP35的作用區(qū)域。 3)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定大分子復(fù)合物：pEGFP-N1-IFP35、pCMV-Nmi和pcDNA-HA-UL23分別轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中,收集蛋白進(jìn)行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,Westen blotting檢測(cè)結(jié)果。 4) Westen blotting檢測(cè)分子間相互關(guān)聯(lián)：將pcDNA-HA-UL23、pcDNA3.1(+)、pcDNA-IFP35-Flag、pEGFP-N1按一定的質(zhì)粒用量比例共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中,Westenblotting檢測(cè)結(jié)果。 結(jié)果： 1)酵母雙雜交系統(tǒng),Co-IP, GST pull-down及共定位等四種方法共同證實(shí)了pUL23能與IFP35相互作用。 2)通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察到病毒蛋白pUL23與IFP35共定位于細(xì)胞質(zhì),并處于細(xì)胞核周邊。 3)pUL23相互作用的重要區(qū)域在594-624bp之間,IFP35相互作用的重要區(qū)域在80-268aa之間,即兩個(gè)串聯(lián)的NID結(jié)構(gòu)域。 4)Nmi、IFP35、pUL23三者在Hela細(xì)胞中能形成一個(gè)大小約為300-400kDa的高分子聚合物。 5)在HEK293細(xì)胞中,隨著pUL23表達(dá)量的增加,IFP35表達(dá)量?jī)H有微量的增加,IFP35的表達(dá)量影響pUL23的表達(dá)量,隨著IFP35表達(dá)量的增加,pUL23表達(dá)量明顯增加。結(jié)論： 本課題運(yùn)用酵母雙雜交、Co-IP、GST pull-down及細(xì)胞共定位四種不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)確定HCMV pUL23與宿主蛋白IFP35相互作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示病毒蛋白pUL23與IFP35共定位于細(xì)胞質(zhì)中,位于細(xì)胞核周邊,pUL23與IFP35的NID結(jié)構(gòu)域相互作用。在細(xì)胞內(nèi),pUL23和IFP35與另一個(gè)干擾素調(diào)控過(guò)程中重要蛋白Nmi形成大分子復(fù)合物,并且pUL23在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量與IFP35的表達(dá)量有關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了病毒蛋白pUL23與宿主細(xì)胞干擾素途徑相關(guān)的分子之間存在密切的關(guān)系,為進(jìn)一步研究病毒蛋白pUL23與宿主細(xì)胞免疫系統(tǒng)相關(guān)性提供了有力的證據(jù)。
【圖文】：

圖1HCMV病毒結(jié)構(gòu)Fig.1ThestruetureofHCMVvirion呈球形，直徑約為200nln[3]，病毒顆粒由外到內(nèi)主要由包膜(enve)、核衣殼(nueleoe叩sid)組成(如圖l)。病毒顆粒的最外層

圖2IFP35的結(jié)構(gòu)圖Fig.2Thes加ctureofIFP35亮氨酸拉鏈基序是由伸展的氨基酸組成，每7個(gè)氨基酸中的第7個(gè)氨基其它疏水性氨基酸，(亮氨酸是疏水性氨基酸)，在第8個(gè)氨基酸處形成
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2534075