【摘要】： 目的: 建立兔尿道缺損模型,探索脂肪間充質(zhì)干細胞復合多孔絲素材料修復尿道缺損的可行性。 方法: 1.脂肪間充質(zhì)干細胞(ADMSCs)分離、培養(yǎng)和純化: 取兔附睪旁脂肪組織,0.15%Ⅰ型膠原酶消化分離、培養(yǎng)ADMSCs細胞,MTT法測定第3代ADMSCs細胞生長曲線,熒光免疫法測定CD44單克隆抗體、Vimentin單克隆抗體。 2.應用復合ADMSCs的多孔絲素材料修復尿道缺損實驗: 選取39只體重約3.0-4.5kg雄性新西蘭大白兔,隨機分3組進行動物實驗:(1)對照組(n=13),(2)多孔絲素材料組(SF組,n=13),(3)BrdU標記的ADMSCs+多孔絲素材料組(SSF組,n=13)。常規(guī)麻醉后于尿道腹側(cè)正中線縱行切開尿道前壁1.5cm,切除2.5×1.0cm~2尿道后壁,建立尿道缺損模型。對照組切除尿道后壁,縫合尿道前壁,術(shù)后留置導尿3w。SF組切除尿道后壁,將多孔絲素材料用Inlay術(shù)式修復尿道缺損后,縫合尿道前壁,術(shù)后留置導尿3w。SSF組切除尿道后壁后,將復合BrdU標記ADMSCs細胞的多孔絲素材料用Inlay術(shù)式修復尿道缺損后,縫合尿道前壁,術(shù)后留置導尿3w。各組動物術(shù)后導尿管每天用呋喃西林沖洗一次。術(shù)后分批處死動物,收集手術(shù)區(qū)尿道標本行HE染色常規(guī)病理檢查,免疫組織化學測定FⅧ-RAg、α-SMA、AE1/AE3陽性細胞,觀察BrdU陽性細胞(SSF組)、巨噬細胞分布情況。所有實驗動物手術(shù)前和處死前均行尿道造影檢查。 主要結(jié)果: 1.ADMSCs細胞的分離、培養(yǎng)和純化: 分離培養(yǎng)2h后,細胞開始貼壁。ADMSCs細胞3d后多呈梭形成纖維細胞樣,培養(yǎng)5-7d后,細胞生長可達80%～90%融合,進行傳代;第3代ADMSCs細胞形態(tài)呈均一的長梭形。常規(guī)培養(yǎng)的第3代ADMSCs細胞MTT曲線示第1、2d為緩慢生長期,3d進入對數(shù)增殖期,11d進入生長平臺期。CD44、Vimentin呈陽性表達。 2.應用復合ADMSCs的多孔絲素材料修復尿道缺損實驗: 2.1尿道造影: 所有實驗動物術(shù)前逆行尿道造影顯示尿道形態(tài)正常,術(shù)后終止實驗前復查逆行尿道造影觀察尿道狹窄和尿瘺的發(fā)生情況。對照組術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率為76.92%(7/13),高于SF組的23.07%(3/13)和SSF組的15.38%(2/13),有顯著性統(tǒng)計學差異(p0.05)。SSF組和SF組術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率無顯著性統(tǒng)計學差異(P0.05)。 2.2大體形態(tài)學觀察: 肉眼觀察,對照組術(shù)后2w尿道缺損區(qū)缺乏內(nèi)襯黏膜,表面凹凸不平,周圍尿道黏膜充血、水腫,術(shù)后4w、6w瘢痕已經(jīng)形成,黏膜收縮,管腔狹窄。SSF組和SF組術(shù)后2w手術(shù)區(qū)絲素材料仍裸露在尿道管腔內(nèi)側(cè)表面,缺乏內(nèi)襯黏膜。術(shù)后4w、6w絲素表面覆蓋黏膜,少量絲素脫落。 組織學觀察:對照組術(shù)后2w尿道缺損區(qū)尿道黏膜上皮未形成,可見大量的淋巴細胞浸潤。術(shù)后4w缺損區(qū)尿道黏膜形成不連續(xù),表面高低不平,黏膜下可見大量淋巴細胞浸潤,纖維組織增生。術(shù)后6w缺損區(qū)尿道黏膜上皮細胞層數(shù)增多,細胞排列不規(guī)則,極性紊亂。黏膜下仍可見大量淋巴細胞浸潤,纖維組織增生,組織結(jié)構(gòu)紊亂,可見散在少量平滑肌纖維。 SF組術(shù)后2w多孔絲素表面沒有上皮細胞形成,在多孔絲素基底部少量血管、膠原纖維組織生長,少量淋巴細胞浸潤,絲素結(jié)構(gòu)完整,未見降解。術(shù)后4w在多孔絲素表面形成復層上皮結(jié)構(gòu),黏膜下可見血管、平滑肌、纖維組織沿著絲素孔隙生長,絲素中部分組織生長不完全,少量淋巴細胞浸潤,絲素結(jié)構(gòu)完整,未見降解。術(shù)后6w在多孔絲素表面形成3-4層上皮細胞,黏膜下可見較多血管、平滑肌、纖維組織沿著絲素孔隙生長,少量淋巴細胞浸潤,絲素結(jié)構(gòu)完整,未見明顯降解。 SSF組術(shù)后2w多孔絲素表面沒有上皮細胞形成,在多孔絲素基底部較多的血管、膠原纖維組織生長,少量淋巴細胞浸潤,絲素結(jié)構(gòu)完整,未見降解。術(shù)后4w在多孔絲素表面形成3-4層上皮細胞,細胞排列不規(guī)則,黏膜下可見大量血管、平滑肌、纖維組織沿著絲素孔隙生長,少量淋巴細胞浸潤,絲素結(jié)構(gòu)完整,未見明顯降解。術(shù)后6w在多孔絲素表面形6-7層上皮細胞,排列規(guī)則。黏膜下可見大量的血管、平滑肌、纖維組織沿著絲素孔隙生長,少量淋巴細胞浸潤,絲素被分解成小塊狀。 2.3巨噬細胞和Brdu、FⅧ-RAg、α-SMA、AE1/AE3陽性細胞分布情況: 術(shù)后2、4、6w于SSF組和SF組絲素間隙和邊緣可見巨噬細胞陽性表達,術(shù)后4w于SSF組巨噬細胞陽性數(shù)分別為11.66±1.58/HP,較同時間點SF組(13.88±2.08/HP)明顯減少,有統(tǒng)計學差異(p0.05) 術(shù)后2、4、6w于SSF組絲素材料中可見散在的Brdu陽性的細胞,在絲素材料與尿道相交處較多。 術(shù)后2、4、6w于SSF組、SF組、對照組尿道手術(shù)缺損區(qū)均可見FⅧ-RAg細胞陽性表達。術(shù)后4w于SSF組、SF組FⅧ-RAg陽性細胞數(shù)分別為23.44±2.40/HP、20.77±2.38/HP,較同時間點對照組(15.11±1.61/HP)明顯增多,有顯著性統(tǒng)計學差異(p0.01);同時SSF組較SF組明顯增多,有統(tǒng)計學差異(P0.05)。 術(shù)后2、4、6w于SSF組、SF組、對照組尿道手術(shù)缺損區(qū)均可見α-SMA細胞陽性表達。術(shù)后4w于SSF組、SF組α-SMA陽性細胞數(shù)分為33.00±3.27/HP、29.00±3.20/HP,較同時間點對照組(16.11±1.53/HP)明顯增多,有顯著性統(tǒng)計學差異(P0.01);同時SSF組較SF組明顯增多,有統(tǒng)計學差異(P0.05) SSF組與SF組中廣譜角蛋白(AE1/AE3)染色陽性,胞漿染成棕黃色,與正常尿道黏膜相似。對照組尿道黏膜與正常尿道黏膜相比,胞漿染成黃色,缺乏尿道上皮復層柱狀上皮形態(tài)。 主要結(jié)論: 脂肪間充質(zhì)干細胞(ADMSCs)細胞易于分離和體外培養(yǎng)擴增,可作為尿道組織工程的種子細胞。應用脂肪間充質(zhì)干細胞復合型多孔絲素材料修復尿道缺損具有一定的可行性。
【圖文】：

第3代ADMSCs細胞形態(tài)（×100）

ADMSCs生長曲線
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329

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本文編號：2532786