【摘要】： 葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxin,SE)是由葡萄球菌產(chǎn)生的一類外毒素,是引起人類食源性疾病的重要致病因子。葡萄球菌腸毒素基因可通過噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo),整合子、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等分子元件的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致新型腸毒素的不斷產(chǎn)生,了解新型腸毒素蛋白的結(jié)構(gòu)與功能,建立相應(yīng)的檢測評價方法具有重要意義。 本研究通過生物信息學(xué)分析,設(shè)計了不同葡萄球菌腸毒素基因(sea,see,seb,sec,ced,tsst,seg,seh,sei,selj,selk,sell,selm,seln,selo,selq,selu)的PCR檢測引物,通過葡萄球菌DNA提取、PCR條件優(yōu)化等,建立了16種不同腸毒素基因型特異性檢測的PCR方法。 應(yīng)用建立的基因分型檢測方法,對分離自生鮮牛奶、奶酪、土壤,人、豬、牛、羊、雞等動物性產(chǎn)品或動物體表、環(huán)境中122株葡萄球菌分離株腸毒素基因型的檢測,初步了解了葡萄球菌國內(nèi)分離株腸毒素基因的分布情況,結(jié)果表明:(1)除selj型陰性外,其它16種基因型均有檢出,95.9%的葡萄球菌含有至少一種SE基因,110株含有一種以上SE基因(90.2%),其中47.5%的菌株攜帶至少5種以上的腸毒素基因型,表明腸毒素基因簇(egc)廣泛存在于葡萄球菌國內(nèi)分離株。腸毒素型檢出率最高的三種腸毒素基因為tsst,sei和seb,分別為62.3%, 54.1%和46.7%,未檢出selj型腸毒素。(2)除金黃色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、中間葡萄球菌、表皮葡萄球菌等已報道的葡萄球菌外,我們分離的非致病性葡萄球菌菌株(豬葡萄球菌、華納氏葡萄球菌、緩慢葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、腐生葡萄球菌、克氏葡萄球菌、雞葡萄球菌、耳葡萄球菌)也檢測到多種葡萄球菌腸毒素基因。動物非致病性葡萄球菌分離株可攜帶多種腸毒素基因,為食品安全帶來新挑戰(zhàn)。(3)葡萄球菌菌株的致病性與其種類、攜帶腸毒素的種類、分離來源密切有關(guān)。分離自病樣,感染能力較強的菌株,產(chǎn)生的腸毒素種類和數(shù)量都多;豬源和雞源的葡萄球菌攜帶除了selj以外的16種腸毒素基因型,兔源和人源攜帶了除selj和sec以外的15種。 通過設(shè)計sea、selo腸毒素基因表達(dá)引物,從含有腸毒素基因簇的葡萄球菌ZNZ2-3分離株成功克隆了兩種葡萄球菌腸毒素sea和selo基因,sea基因與GenBank已報道序列完全一致, selo發(fā)生點突變,但該突變?yōu)橥x突變。應(yīng)用克隆基因構(gòu)建了兩種腸毒素的融合表達(dá)載體pEGX-6P-SEA和pEGX-6P-SEO,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21宿主菌,經(jīng)誘導(dǎo)后獲得了重組融合蛋白,重組蛋白分別占菌體蛋白的26%和22%。經(jīng)親和層析純化獲得重組腸毒素蛋白,Western-Blot檢測表明,表達(dá)的重組蛋白能夠被SEA和SEO陽性血清識別,具有良好的抗原性。
【圖文】：

毒素檢測 PCR 反應(yīng)程序：min；94℃變性 30s，按照各型 Tm（表 2；94℃變性 30s，51℃退火 40s，，72℃延4℃保溫 6min。CR 產(chǎn)物進(jìn)行 1%的瓊脂糖凝膠電泳， 1行結(jié)果分析。析菌分子生物學(xué)方法鑒定es 報道的方法對疑似葡萄球菌進(jìn)行 PCRM 1 2 3 4 5 6

章 葡萄球菌腸毒素基因檢測 PCR 技術(shù)的菌，說明該方法對各個種屬的葡萄球法的確定采取了堿裂解法，在提取過程中分別入少量溶菌酶后，DNA 的豐度明顯效果不明顯，實驗最終確定在堿裂解提取方法 PCR 結(jié)果見圖 2-3。M 1 2 3 4 5
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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1 李毅;金黃色葡萄球菌及其腸毒素研究進(jìn)展[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2004年04期

本文編號：2532087