【摘要】： 背景: B7-H4,又稱B7S1或B7x,是共刺激分子B7家族的最新成員,為Ⅰ型跨膜糖蛋白,編碼282個氨基酸。由美國Mayo醫(yī)學(xué)中心于2003年發(fā)現(xiàn),是B7家族相關(guān)的第3個T細(xì)胞抗原特異性反應(yīng)的負(fù)性調(diào)控分子。人B7-H4的cDNA長約1.8Kb,位于人的染色體1p11.1,在基因組上跨越66Kbp。B7-H4的mRNA在淋巴和非淋巴組織中都有表達(dá),但免疫組化顯示,B7-H4蛋白僅在部分正常組織中微弱的表達(dá)。B7-H4可以在活化的人T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞上呈誘導(dǎo)性表達(dá)。業(yè)已發(fā)現(xiàn),一些腫瘤細(xì)胞也呈組成性表達(dá)B7-H4,如乳腺癌、卵巢癌和肺癌等。對小鼠組織的Northern Blot實驗發(fā)現(xiàn),根據(jù)組織類型的不同,小鼠的B7-H4共有四種不同的mRNA剪切形式。RT-PCR分析顯示,人類的組織至少擁有兩個轉(zhuǎn)錄本。研究表明,正常外周組織能在翻譯水平對B7-H4的表達(dá)進(jìn)行嚴(yán)密的調(diào)控。 在機體的免疫應(yīng)答過程中,B7-H4作為重要的共刺激分子,在CD4~+、CD8~+T細(xì)胞的分化發(fā)育、細(xì)胞周期進(jìn)展以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生等方面發(fā)揮廣泛的抑制效應(yīng)。B7-H4對外周組織的細(xì)胞免疫應(yīng)答起著負(fù)性調(diào)節(jié)的作用,且由于其特異性表達(dá)于某些腫瘤細(xì)胞表面,因而可能在機體的腫瘤免疫逃避機制中起著重要作用。 因此,B7-H4分子途徑為腫瘤、自身免疫性疾病和抗病毒及移植排斥反應(yīng)等疾病提供了新的治療思路。阻斷B7-H4與其受體的相互作用,有望成為干預(yù)自身免疫性疾病和腫瘤生物治療的潛在靶點。 目的: 為了更深入研究B7-H4與腫瘤免疫的關(guān)系,本實驗設(shè)計并合成了人B7-H4多肽,應(yīng)用該多肽制備了兔抗人B7-H4多克隆抗體,并應(yīng)用該抗體研究B7-H4分子在多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中的表達(dá),并探討其意義。 方法: 1.根據(jù)GenBank公布的序列(AAP37283),利用計算機輔助設(shè)計,確定并人工合成B7-H4抗原多肽,并用Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH)交聯(lián)以增強B7-H4抗原多肽的免疫原性。將交聯(lián)KLH的B7-H4抗原肽免疫新西蘭兔(經(jīng)初次免疫和四次加強免疫)后獲取免疫兔血清,親和純化法純化兔血清中的抗B7-H4抗體。采用直接ELISA法、Western-blot免疫印跡鑒定抗B7-H4抗體的效價、反應(yīng)的特異性和敏感性; 2.免疫組織化學(xué)染色檢測組織芯片上多種腫瘤組織中人B7-H4蛋白的表達(dá)情況; 3.根據(jù)GenBank公布的序列(NM_024626),合成了h B7-H4的PCR引物,應(yīng)用RT-PCR檢測多種腫瘤細(xì)胞株中人B7-H4mRNA的表達(dá); 4.Western-Blot檢測多種腫瘤細(xì)胞株中人B7-H4蛋白的表達(dá)。 結(jié)果: 1.成功制備了兔抗人B7-H4多克隆抗體; 2.免疫組化檢測結(jié)果顯示肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、直腸癌及腎癌等多種腫瘤組織的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿均有B7-H4蛋白的陽性染色,而在各種對照的正常組織中僅表達(dá)為陰性至弱陽性; 3.RT-PCR結(jié)果顯示8種腫瘤細(xì)胞株在目的條帶1200bp左右處均有B7-H4mRNA的表達(dá); 4.Western-Blot檢測9種細(xì)胞株中B7-H4蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示A549、MCF-7、SK-BR-3、CaoV3、SK-OV-3、SiHa、HeLa、HepG2等腫瘤細(xì)胞株均表達(dá)B7-H4蛋白,而A293細(xì)胞株未檢測到B7-H4蛋白表達(dá)。 結(jié)論: 1.成功制備了兔抗人B7-H4多克隆抗體; 2.肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、直腸癌及腎癌等多種腫瘤組織的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿均有B7-H4蛋白的陽性染色; 3.A549、MCF-7、SK-BR-3、CaoV3、SK-OV-3、SiHa、HeLa、HepG2等腫瘤細(xì)胞株均有B7-H4mRNA和B7-H4蛋白的表達(dá);
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圖1.2兔抗B7一 H4aaZ血清的洗脫記錄3.3、vestern一Blot檢測兔抗人B7一H4多膚的血清和純化后兔抗aal多膚的多抗分別與A549和MCF一7細(xì)胞株中一抗原的反應(yīng)性見圖1.3和圖 1.425我月~:、涪2洲乃圖1.3、Vesteru一Blot檢測兔杭人B7一H4血清1.1號兔的兔抗aaZ多膚血清1:500稀釋;aal和

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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392;R730.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 孫玉萍;劉杰;崔霞;趙東;劉惠萍;汪運山;;B7-H4在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的臨床意義[J];山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2006年06期

本文編號：2532028