【摘要】： 血漿中存在約上萬種蛋白質,濃度從pg/mL到mg/mL,在血漿蛋白質組學研究中低豐度蛋白的檢測常被高豐度蛋白干擾。因此,有必要對血漿樣品進行預分離。預分離的目標是去除高豐度蛋白或直接富集低豐度蛋白。 去除高豐度蛋白的方法有密度梯度離心、化學沉淀、膜截留、配體吸附(染料、抗體、多肽等)等。直接富集低豐度蛋白的方法有凝集素富集糖蛋白、金屬表面吸附磷酸化蛋白、疏水微球吸附多肽或小分子蛋白等。血漿蛋白質組學研究目前常用高豐度蛋白去除后的樣品進行。國外采取多克隆抗體(IgG,IgY)制備的親和填料進行預分離。經一系列評價后發(fā)現(xiàn)具有很高的結合特異性,但也存在一定缺點如各操作系統(tǒng)間不兼容,有非特異吸附,抗體失活速率不均一等。目前未見國內有制備血漿高豐度蛋白質去除填料的相關研究報導,這與國內快速發(fā)展的蛋白質組學研究不相稱。 高豐度蛋白在樣品中含量高,需高載量的親和填料才能實現(xiàn)較理想的分離�？贵w分子共價固定常用CNBr活化的瓊脂糖法,但如果是抗體Fab段氨基而不是Fc段氨基與填料CNBr基團反應,就會因空間阻礙而失去一定的結合能力,不同抗體的Fab段氨基活性與Fc段氨基活性不同,因此抗體結合活性與這兩區(qū)域的氨基活性比有關。利用抗體的Fc段糖基可實現(xiàn)定向固定,糖基氧化為醛基后與載體上氨基連接,但該方法在實際反應過程中會發(fā)生自偶聯(lián)現(xiàn)象,即抗體分子間的氨基和醛基形成多聚體,使抗體結合活性下降,且單克隆抗體的糖基含量不同,固定效率也不同。以Prein G/A吸附抗體,然后用DMP(Dimethylpimelinediimidate chloride,庚二亞氨酸二甲酯二鹽酸鹽)使之與Protein G/A蛋白共價交聯(lián),使抗體定向固定在ProteinG/A,反應條件較溫和。 親和填料在高豐度蛋白去除過程中存在非特異吸附蛋白的現(xiàn)象,主要是樣品與容器表面,樣品與支持填料,樣品中蛋白與蛋白相互作用。不同親和填料、色譜系統(tǒng)和樣品處理所表現(xiàn)的非特異吸附各不相同,因此研究者提出“分離”而非“去除”的高豐度蛋白分離策略。因此鑒定每種親和填料及其操作系統(tǒng)的非特異吸附蛋白群是后續(xù)蛋白質組研究的必要數(shù)據(jù)。相比于多克隆抗體,單克隆抗體技術成熟可靠,易大量制備和質量控制,與抗原的特定表位結合,具有有更可靠的吸附蛋白重復性。 研究目的及意義:1)進行抗體固定方法的比較,選擇有效的抗體固定方法。2)篩選合適的單抗,使填料具有最大的吸附量和反復吸附-洗脫能力。3)鑒定該單克隆抗體制備的親和填料吸附蛋白,為后續(xù)血漿蛋白質組學研究提供數(shù)據(jù)。 材料和方法:1)參考CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare,USA)、CarboLink~(TM) Coupling Gel(PIERCE Cat 20391)和POROS(?) 20XL MediaImmobilizing Antibody for Perfusion Immunoassays技術手冊,用1mg抗白蛋白抗體固定于6mL膠(50%體積),電泳檢測抗體吸附能力。2)14株抗白蛋白單克隆抗體和15株抗球蛋白抗體用Protein G/A-mAb法固定(1mg抗體:0.6mL膠),制備好的膠放入SpinX Tube中,加入15μL人血漿,孵育30分鐘后3000g離心1分鐘,收集流穿液1;加入0.1M PBS 300μL,混勻1分鐘,3000g離心1分鐘,收集流穿液2:重復3次;加入0.1M Gly-HCI pH2.5洗脫,收集洗脫液。合并流穿液1-4組份為分離高豐度蛋白后的血漿樣品。SDS-PAGE分析實驗結果。4)用0.2mg,0.5mg,1mg,5mg白蛋白和球蛋白對固定的2種白蛋白、4種球蛋白抗體載量進行測試。5)洗脫樣品經雙向電泳后進行MALDI-TOF/TOF質譜鑒定,每個點選3-6個母離子峰進行二級質譜分析,經Mascot檢索后確定蛋白質。 結果:1)Protein G/A-mAb法固定有效抗體最多。2)白蛋白,球蛋白單克隆抗體進行篩選后顯示抗白蛋白抗體HPSIIB002、HPSIIB007;抗球蛋白抗體HPSIA010、HPSIA020、HPSIA025、HPSIIB011有良好的吸附-洗脫行為:實驗結果顯示400μL(1mg白蛋白單體、0.333mg球蛋白單抗)膠能分離10μL血漿中的白蛋白;處理后的血漿樣品在SDS-PAGE和2-DE實驗中能明顯消除高豐度蛋白帶來的影響;重復使用十次后結合能力無明顯降低,但免疫印跡實驗顯示高豐度蛋白碎片在流穿液中增加;3)HPSIIB007白蛋白抗體和HPSIA010球蛋白抗體具有較高載量,最高結合摩爾比例分別為1:1.5和1:05左右。4)對非特異的吸附的蛋白進行了2-DE,MALDI-TOF/TOF鑒定,檢測的110個點中,89個為白蛋白,球蛋白及其碎片,占80.9%。未檢出7個點,檢出率為93.6%。表明存在與填料非特異吸附,確定的吸附蛋白為:抗胰蛋白酶,Vitamin D結合蛋白,CD5抗原相似蛋白,纖維蛋白原,keratin 10,前脂蛋白,Transthyrentin,脂蛋白A-1,補體C3,轉鐵蛋白。 結論:篩選出2株白蛋白單克隆抗體和4株球蛋白抗體適合親和填料的吸附-洗脫操作;確定了Protein G/A-mAb法固定有效抗體最多;測試了親和填料的載量和十次吸附-洗脫去除實驗,吸附載量無明顯下降,可適合多次重復操作;確定了該填料和操作平臺下的非特異吸附蛋白圖譜,為血漿蛋白質組研究提供必要數(shù)據(jù)。本研究用單克隆抗體實現(xiàn)了高豐度蛋白的去除填料的研發(fā),操作方便,不需復雜色譜設備,為血漿蛋白學研究提供了有效的平臺。該親和填料已在本校中醫(yī)系的血漿蛋白質組研究中得到應用。該技術平臺可用于開發(fā)其它樣品如唾液、腦脊液、尿液中的高豐度蛋白去除親和填料。
【圖文】：

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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：2531877