【摘要】： TRBP全長(zhǎng)366aa,屬于dsRNA結(jié)合蛋白家族,具有3個(gè)dsRBD,位于dsRBD2內(nèi)部的KR-螺旋模序負(fù)責(zé)RNA結(jié)合,第三個(gè)結(jié)構(gòu)域即C末端堿性結(jié)構(gòu)域主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)間的相互作用。1991年,TRBP首先作為HIV-1反式激活應(yīng)答RNA結(jié)合蛋白被分離鑒定出來(lái),它具有多種生物學(xué)功能,包括調(diào)控精子生成與發(fā)育、抑制PKR激活、調(diào)節(jié)HIV-1基因表達(dá)、參與RNAi過(guò)程等。TRBP是PKR的強(qiáng)抑制物,它通過(guò)直接結(jié)合和dsRNA扣押而發(fā)揮作用。TRBP不依賴PKR而依賴結(jié)構(gòu)RNA,對(duì)翻譯也有直接作用。TRBP促進(jìn)HIV-1的表達(dá)和復(fù)制,在星形膠質(zhì)細(xì)胞中PKR的高應(yīng)答導(dǎo)致了HIV-1的低復(fù)制和病毒結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯低下,而TRBP抑制PKR激活,使病毒蛋白產(chǎn)生恢復(fù),從而增強(qiáng)了HIV復(fù)制。研究表明TRBP通過(guò)對(duì)抗PKR介導(dǎo)的抗病毒免疫而在病毒翻譯中具有關(guān)鍵作用。 2005年,刊登在Nature和EMBO的兩篇文章報(bào)道說(shuō)TRBP與作為RISC組分的Dicer相結(jié)合,TRBP、Ago2和Dicer都在miRNA加工和RNAi中發(fā)揮作用。TRBP在dsRNA和Dicer之間募集Ago2時(shí)起到橋梁作用, TRBP或Dicer缺失后成熟miRNA產(chǎn)生減少和siRNA功能的喪失,他們推斷TRBP募集Ago2到Dicer,將RNAi的啟動(dòng)和執(zhí)行階段相偶聯(lián)。TRBP與RNaseⅢ家族成員Dicer相互作用,并結(jié)合dsRNA,隨后結(jié)合具有裂解dsDNA活性的Ago2蛋白,它們共同組成RISC復(fù)合體。dsRNA的一條鏈被遞呈給Ago2蛋白從而導(dǎo)致siRISC和miRISC的產(chǎn)生。但是,TRBP哪個(gè)結(jié)構(gòu)域在RNAi中發(fā)揮作用以及以哪個(gè)結(jié)構(gòu)域與Ago2相互作用尚未完全闡明。 為了進(jìn)一步探討TRBP與Ago2間的相互作用,我們用PCR方法克隆了TRBP全長(zhǎng)基因,構(gòu)建了只含有兩個(gè)dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的截短/重組基因TAB、TAC和TBC,并克隆入真核表達(dá)載體pFlag-CMV4中,經(jīng)DNA測(cè)序,證實(shí)獲得序列正確,分別命名為pFlag-CMV4-TRBP、pFlag-CMV4-TAB、pFlag-CMV4-TAC和pFlag-CMV4-TBC。 將pFlag-CMV4-TRBP、pFlag-CMV4-TAB、pFlag-CMV4-TAC和pFlag-CMV4-TBC質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中檢測(cè)到了目的基因的表達(dá)。各質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞,并穩(wěn)定建株,裂解細(xì)胞通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)TRBP全長(zhǎng)及其截短/重組體分子與Ago2、Dicer分子的相互作用,發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)及各截短/重組體分子均與Ago2、Dicer分子存在相互作用。我們用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot的方法對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行了篩選,證實(shí)了TRBP在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中低表達(dá)。雙熒光素檢測(cè)表明,TRBP低表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、C6、U87、和SHG44 RNA干擾作用降低。同樣,利用干擾β-Actin的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和U251細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)TRBP低表達(dá)的U251細(xì)胞干擾作用降低。 綜上所述,我們構(gòu)建了TRBP全長(zhǎng)及其截短/重組體真核表達(dá)載體,并初步檢測(cè)了其功能,為進(jìn)一步研究其功能機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)材料系細(xì)胞系 HeLa、人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 U251, 大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系系 U87, 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 SHG44 為本室保存。與質(zhì)粒菌 DH5α菌種為本室保存。Flag-CMV4 為本室保存。L3-Hid 由張勇博士構(gòu)建。

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文圖4 質(zhì)粒pGL3-Basic Vector圖譜Figure 1. pGL3-Basic Vector circle map.四、主要試劑RPMI 1640 和 DMEM 培養(yǎng)基 Gibco 公司小牛血清 杭州四季青生物制品公司二甲基亞砜（DMSO），， Sigma 公司SuperScriptTMpreamplification system， Gibco 公司Taq DNA polymerase Gibco 公司柱式質(zhì)粒（小量）純化試劑盒 上海華舜生物工程公司柱式膠回收試劑盒 上海華舜生物工程公司ConcertTMPlasmid Midiprep Sys
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王帥;對(duì)蝦抗病毒相關(guān)蛋白的分子克隆與功能研究[D];山東大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 魏曉明;DFFA和PSMC3在RNA干擾功能中的調(diào)控作用[D];天津醫(yī)科大學(xué);2008年

2 劉寧;對(duì)蝦血細(xì)胞T7噬菌體展示文庫(kù)構(gòu)建及功能基因淘選[D];山東大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2530874