【摘要】： 細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)和自然殺傷細(xì)胞(NK)是體內(nèi)參加抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞,直接釋放細(xì)胞毒顆粒是這兩種細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的主要機(jī)制。細(xì)胞毒顆粒主要由效應(yīng)分子穿孔素(PFN)、顆粒溶素(GNLY)和顆粒酶組成。CIK細(xì)胞(cytokine-induced killer)是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)在體外用多種細(xì)胞因子(如抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ、IL-1α)誘導(dǎo)培養(yǎng)后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。CIK對(duì)腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷活性,病人自體細(xì)胞誘導(dǎo)后回輸CIK輔助治療腫瘤的方法已經(jīng)在臨床上得到應(yīng)用。但CIK細(xì)胞毒活性增強(qiáng)的分子機(jī)理尚不明了。我們測(cè)定了健康人和腫瘤患者PBMC以及CIK細(xì)胞的抗腫瘤活性,同時(shí)也檢測(cè)了兩種細(xì)胞中PFN和GNLY蛋白的表達(dá)情況,初步分析研究CIK細(xì)胞活性增強(qiáng)的分子機(jī)理。進(jìn)行了PFN-N端真核放射誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建和在肺癌細(xì)胞中表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證了通過(guò)X射線的方法來(lái)控制細(xì)胞中與癌癥相關(guān)的外源基因表達(dá)的可行性。 一、CIK細(xì)胞毒活性增強(qiáng)的機(jī)理研究 1.健康人和腫瘤患者PBMC細(xì)胞毒活力及細(xì)胞毒效應(yīng)分子的測(cè)定。采集4名健康人和10名惡性腫瘤患者外周血10ml,分離PBMC細(xì)胞,一部分用直接熒光標(biāo)記法分析細(xì)胞毒效應(yīng)分子PFN和GNLY的表達(dá),一部分用LDH釋放法進(jìn)行PBMC細(xì)胞對(duì)K562的殺傷活性測(cè)定。還有部分細(xì)胞用于誘導(dǎo)培養(yǎng)形成CIK細(xì)胞。 2.健康人和腫瘤病人CIK細(xì)胞毒活力及細(xì)胞毒效應(yīng)分子的測(cè)定。將上述PBMC用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10天獲得CIK細(xì)胞,同上方法進(jìn)行CIK細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白的表達(dá)測(cè)定及對(duì)K562的殺傷活性測(cè)定。將誘導(dǎo)后的兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較,并分別將健康人和腫瘤病人細(xì)胞誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。 結(jié)果顯示,腫瘤病人PBMC對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活力顯著低于健康人(P＜0.05),而且細(xì)胞毒效應(yīng)分子PFN、GNLY表達(dá)水平也低于健康人;誘導(dǎo)培養(yǎng)后,腫瘤患者和健康人的CIK對(duì)K562的殺傷活力都比PBMC有大幅度的提高,且腫瘤病人為顯著提高(P＜0.01);細(xì)胞毒效應(yīng)分子在二組CIK細(xì)胞中的表達(dá)量發(fā)生分歧:健康人和腫瘤患者CIK細(xì)胞GNLY表達(dá)量都較PBMC增高,腫瘤患者實(shí)驗(yàn)組增高顯著(P＜0.01),但PFN表達(dá)都顯著降低(P＜0.05)。 結(jié)果表明,腫瘤病人CIK細(xì)胞殺傷活性提高與GNLY基因的表達(dá)量升高具有正相關(guān)性。而PFN基因表達(dá)量卻有所降低,這一現(xiàn)象可能與淋巴細(xì)胞某種自我反饋調(diào)節(jié)途徑相關(guān)。 二、人穿孔素N末端肽段的放射誘導(dǎo)表達(dá)研究 早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1(early growth response-1,Egr-1)基因啟動(dòng)子區(qū)含有6個(gè)高度保守的CC(A+T)_6GG基序(motif),可在電離輻射產(chǎn)生的氧自由基刺激下誘導(dǎo)下游基因的表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因表達(dá)的時(shí)空調(diào)控。穿孔素(perforin,PFN)在腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用,而且第一部分的研究結(jié)果證實(shí)了,很多腫瘤患者的外周血淋巴細(xì)胞中PFN的表達(dá)量低于健康人,這與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著不可忽略的聯(lián)系。因此,我們擬采用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PFN生物學(xué)活性片段,以期在體外研究PFN片段蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。我們利用上述Egr-1啟動(dòng)子的特性,將人穿孔素氨基端片段連接到Egr-1啟動(dòng)子下游,構(gòu)建成真核表達(dá)載體,對(duì)其進(jìn)行放射誘導(dǎo)表達(dá)研究。 1.構(gòu)建人PFN-N肽段的真核放射誘導(dǎo)表達(dá)載體。以克隆有hPFN全長(zhǎng)cDNA序列的載體pcDNA3.1(+)/hPFN為模板,設(shè)計(jì)PFN-N基因的上下游引物,用PCR擴(kuò)增hPFN-N,經(jīng)Nhe I、Kpn I雙酶切后,將該基因片斷克隆到含放射誘導(dǎo)啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/Egr-1中,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選,并通過(guò)PCR和雙酶切法鑒定為所需重組質(zhì)粒。 2.PFN-N端基因在肺癌細(xì)胞SPC-Al中的放射誘導(dǎo)表達(dá)。在脂質(zhì)體作用下將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SPC-Al細(xì)胞,經(jīng)過(guò)X射線的放射誘導(dǎo)后,應(yīng)用RT-PCR、細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)hPFN-N蛋白的表達(dá),用MTT法測(cè)定該蛋白對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果顯示,成功構(gòu)建了真核放射誘導(dǎo)表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/Egr-hPFN-N。以重組體轉(zhuǎn)染SPC-Al細(xì)胞后,用RT-PCR檢測(cè)到hPFN-N mRNA的表達(dá)。細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性反應(yīng),MTT法檢測(cè)結(jié)果為rhPFN-N對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活力為29.2%。 本實(shí)驗(yàn)成功的構(gòu)建了PFN-N端的真核放射誘導(dǎo)表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)了人PFN-N在肺癌細(xì)胞中的表達(dá),并證明了該基因的表達(dá)可受X射線的時(shí)空調(diào)控,并且基因產(chǎn)物對(duì)靶細(xì)胞具有一定的殺傷作用。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R392;R730.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號(hào)：2531313