【摘要】： 細胞毒T細胞(CTL)和自然殺傷細胞(NK)是體內(nèi)參加抗腫瘤免疫的主要效應細胞,直接釋放細胞毒顆粒是這兩種細胞殺傷靶細胞的主要機制。細胞毒顆粒主要由效應分子穿孔素(PFN)、顆粒溶素(GNLY)和顆粒酶組成。CIK細胞(cytokine-induced killer)是將人外周血單個核細胞(PBMC)在體外用多種細胞因子(如抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ、IL-1α)誘導培養(yǎng)后獲得的一群異質(zhì)細胞。CIK對腫瘤細胞具有很強的殺傷活性,病人自體細胞誘導后回輸CIK輔助治療腫瘤的方法已經(jīng)在臨床上得到應用。但CIK細胞毒活性增強的分子機理尚不明了。我們測定了健康人和腫瘤患者PBMC以及CIK細胞的抗腫瘤活性,同時也檢測了兩種細胞中PFN和GNLY蛋白的表達情況,初步分析研究CIK細胞活性增強的分子機理。進行了PFN-N端真核放射誘導表達載體的構(gòu)建和在肺癌細胞中表達,進一步驗證了通過X射線的方法來控制細胞中與癌癥相關的外源基因表達的可行性。 一、CIK細胞毒活性增強的機理研究 1.健康人和腫瘤患者PBMC細胞毒活力及細胞毒效應分子的測定。采集4名健康人和10名惡性腫瘤患者外周血10ml,分離PBMC細胞,一部分用直接熒光標記法分析細胞毒效應分子PFN和GNLY的表達,一部分用LDH釋放法進行PBMC細胞對K562的殺傷活性測定。還有部分細胞用于誘導培養(yǎng)形成CIK細胞。 2.健康人和腫瘤病人CIK細胞毒活力及細胞毒效應分子的測定。將上述PBMC用誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10天獲得CIK細胞,同上方法進行CIK細胞內(nèi)兩種蛋白的表達測定及對K562的殺傷活性測定。將誘導后的兩組實驗結(jié)果進行比較,并分別將健康人和腫瘤病人細胞誘導前與誘導后的實驗結(jié)果進行比較。 結(jié)果顯示,腫瘤病人PBMC對K562細胞的殺傷活力顯著低于健康人(P＜0.05),而且細胞毒效應分子PFN、GNLY表達水平也低于健康人;誘導培養(yǎng)后,腫瘤患者和健康人的CIK對K562的殺傷活力都比PBMC有大幅度的提高,且腫瘤病人為顯著提高(P＜0.01);細胞毒效應分子在二組CIK細胞中的表達量發(fā)生分歧:健康人和腫瘤患者CIK細胞GNLY表達量都較PBMC增高,腫瘤患者實驗組增高顯著(P＜0.01),但PFN表達都顯著降低(P＜0.05)。 結(jié)果表明,腫瘤病人CIK細胞殺傷活性提高與GNLY基因的表達量升高具有正相關性。而PFN基因表達量卻有所降低,這一現(xiàn)象可能與淋巴細胞某種自我反饋調(diào)節(jié)途徑相關。 二、人穿孔素N末端肽段的放射誘導表達研究 早期生長反應因子1(early growth response-1,Egr-1)基因啟動子區(qū)含有6個高度保守的CC(A+T)_6GG基序(motif),可在電離輻射產(chǎn)生的氧自由基刺激下誘導下游基因的表達,從而實現(xiàn)對目的基因表達的時空調(diào)控。穿孔素(perforin,PFN)在腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用,而且第一部分的研究結(jié)果證實了,很多腫瘤患者的外周血淋巴細胞中PFN的表達量低于健康人,這與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著不可忽略的聯(lián)系。因此,我們擬采用真核表達系統(tǒng)表達PFN生物學活性片段,以期在體外研究PFN片段蛋白對腫瘤細胞的殺傷作用。我們利用上述Egr-1啟動子的特性,將人穿孔素氨基端片段連接到Egr-1啟動子下游,構(gòu)建成真核表達載體,對其進行放射誘導表達研究。 1.構(gòu)建人PFN-N肽段的真核放射誘導表達載體。以克隆有hPFN全長cDNA序列的載體pcDNA3.1(+)/hPFN為模板,設計PFN-N基因的上下游引物,用PCR擴增hPFN-N,經(jīng)Nhe I、Kpn I雙酶切后,將該基因片斷克隆到含放射誘導啟動子的真核表達載體pcDNA3.1(+)/Egr-1中,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109進行陽性克隆篩選,并通過PCR和雙酶切法鑒定為所需重組質(zhì)粒。 2.PFN-N端基因在肺癌細胞SPC-Al中的放射誘導表達。在脂質(zhì)體作用下將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SPC-Al細胞,經(jīng)過X射線的放射誘導后,應用RT-PCR、細胞免疫化學法檢測hPFN-N蛋白的表達,用MTT法測定該蛋白對靶細胞的殺傷活性。結(jié)果顯示,成功構(gòu)建了真核放射誘導表達載體pcDNA3.1(+)/Egr-hPFN-N。以重組體轉(zhuǎn)染SPC-Al細胞后,用RT-PCR檢測到hPFN-N mRNA的表達。細胞免疫化學法檢測結(jié)果呈陽性反應,MTT法檢測結(jié)果為rhPFN-N對靶細胞的殺傷活力為29.2%。 本實驗成功的構(gòu)建了PFN-N端的真核放射誘導表達載體,實現(xiàn)了人PFN-N在肺癌細胞中的表達,并證明了該基因的表達可受X射線的時空調(diào)控,并且基因產(chǎn)物對靶細胞具有一定的殺傷作用。
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392;R730.5

【參考文獻】

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本文編號：2531313