【摘要】： 血細(xì)胞輸注和造血干細(xì)胞移植是臨床上治療嚴(yán)重創(chuàng)傷、惡性血液性疾病、重癥再生障礙性貧血、免疫缺陷綜合征、地中海貧血等疾病的有效手段。目前血源緊張報(bào)道非常普遍,因輸血引起的疾病傳播嚴(yán)重威脅著人們的健康,在獻(xiàn)血志愿者之外尋求安全、可靠、充足、有效的血液來(lái)源是從事輸血研究工作的科研人員的職責(zé)和追求。干細(xì)胞領(lǐng)域的研究給人們提供了一個(gè)潛在血液替代來(lái)源的選擇。 干細(xì)胞具有自我更新和高度分化潛能,可以通過(guò)細(xì)胞分裂產(chǎn)生表型與基因型完全相同的子細(xì)胞以維持自身群體大小,同時(shí)又可以進(jìn)一步分化產(chǎn)生至少一種類型高度分化的子細(xì)胞。造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSCs)一直以來(lái)是科學(xué)家們研究的重要領(lǐng)域之一,很多有關(guān)干細(xì)胞特性和應(yīng)用的探討都是從HSCs深入和拓展的。由于HSCs在機(jī)體的比例很低且體外擴(kuò)增及干性維持困難,其數(shù)量成為限制體外誘導(dǎo)成熟紅細(xì)胞應(yīng)用的瓶頸。但作為血細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié),HSCs對(duì)于研究紅細(xì)胞的定向分化具有非常重要的意義。 隨著干細(xì)胞研究及其相關(guān)領(lǐng)域生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,尤其是以ES細(xì)胞為啟動(dòng)細(xì)胞的HSCs工程為臨床輸血和干細(xì)胞的移植帶來(lái)了新希望。ES細(xì)胞具有理論上無(wú)限的自我更新和分化為機(jī)體所有類型細(xì)胞的能力,以ES為啟動(dòng)細(xì)胞可使我們可以獲得足夠的早期造血干/祖細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),從源頭上解決體外由人造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSCs)誘導(dǎo)紅細(xì)胞種子細(xì)胞總量不足的問(wèn)題。由hES細(xì)胞誘導(dǎo)紅細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,有許多關(guān)鍵性技術(shù)問(wèn)題需要解決,包括:hES細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的干性維持,hES細(xì)胞向造血干細(xì)胞特異性誘導(dǎo)分化及其效率的提高;造血干細(xì)胞向紅細(xì)胞特異性分化體系的優(yōu)化;紅細(xì)胞的脫核成熟及功能鑒定;誘導(dǎo)獲得的紅細(xì)胞的安全性評(píng)價(jià)等。 針對(duì)如上問(wèn)題,我們首先建立了一個(gè)體外誘導(dǎo)臍帶血造血干/祖細(xì)胞向紅系細(xì)胞特異性分化的方法,并通過(guò)與特定飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng),最終得到了脫核的紅細(xì)胞。與此同時(shí),我們還鑒定了誘導(dǎo)產(chǎn)生的紅細(xì)胞部分功能和安全性,并在此基礎(chǔ)之上,以hES細(xì)胞為啟動(dòng)細(xì)胞的進(jìn)行了造血誘導(dǎo)的初步探索,得到了一定比例的造血干細(xì)胞,為最終由hES細(xì)胞誘導(dǎo)成熟的紅細(xì)胞奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。 本課題研究?jī)?nèi)容由以下三部分組成。 第一部分臍帶血造血干細(xì)胞的分離、紅系誘導(dǎo)分化及脫核 首先,我們采用了免疫磁珠分選法,從臍帶血單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells, MNCs)分離出臍帶血HSCs,分離的HSCs占單個(gè)核細(xì)胞比例為0.82~0.86%,與文獻(xiàn)報(bào)道的相當(dāng),流式細(xì)胞術(shù)鑒定其純度在90%以上。我們采取了無(wú)血清懸浮培養(yǎng)體系將HSCs向紅系特異性誘導(dǎo)。誘導(dǎo)體系內(nèi)添加了包括干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)、促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,Epo)、類胰島素樣生長(zhǎng)因子1(Insulin-like Growth Factor I,IGF-1)以及地塞米松(Dexamethasone,DXM)等功能成分。通過(guò)7天的誘導(dǎo),可獲得50~70%的紅系祖細(xì)胞,在誘導(dǎo)10天之后,紅系細(xì)胞的比例可達(dá)90%。經(jīng)顯微鏡下形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)觀察、瑞氏——吉姆薩染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志和細(xì)胞周期、半固體克隆、RT-PCR檢測(cè)紅系相關(guān)基因的表達(dá)等方法對(duì)其紅系分化的效果進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明,我們實(shí)驗(yàn)中所建立的這一方法可以特異性的誘導(dǎo)臍帶血造血干細(xì)胞向紅系細(xì)胞定向分化。 造血微環(huán)境在紅細(xì)胞的脫核過(guò)程中發(fā)揮重要作用,而基質(zhì)細(xì)胞則是造血微環(huán)境中發(fā)揮這種作用的關(guān)鍵的成分之一。人胚胎第9~21周,造血中心轉(zhuǎn)移至肝臟。肝臟是胎兒時(shí)期主要的造血器官,以紅系造血為主。處于這一階段的胎肝組織對(duì)于造血特別是紅系發(fā)育具有非常重要的意義。經(jīng)患者知情同意,我們分離14周齡的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞,RT-PCR結(jié)果表明,此細(xì)胞表達(dá)多種促進(jìn)造血發(fā)育的基因,同時(shí)還表達(dá)TGF-β等促進(jìn)紅細(xì)胞成熟的基因。我們以其作為飼養(yǎng)層細(xì)胞與紅系祖細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)脫核。檢測(cè)結(jié)果表明,在共培養(yǎng)條件下,紅系細(xì)胞繼續(xù)分化成熟,晚期紅細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)90%以上,較之于共培養(yǎng)之前顯著增加。而瑞氏——吉姆薩染色后觀察到的脫核紅細(xì)胞則直觀的證明了本體系可使紅系細(xì)胞脫核成熟。 第二部分誘導(dǎo)分化的紅系細(xì)胞的功能鑒定 血紅蛋白(Hb)是紅細(xì)胞的主要成分,同時(shí)也是紅細(xì)胞運(yùn)輸氧氣的功能分子。Hb是紅細(xì)胞行使功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),攜氧能力是紅細(xì)胞行使功能的具體體現(xiàn)。本部分實(shí)驗(yàn)中,我們對(duì)紅細(xì)胞氣體運(yùn)輸功能進(jìn)行了檢測(cè)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),血紅蛋白在總蛋白中的比例由誘導(dǎo)之初幾乎沒(méi)有表達(dá)升至第5天的2%,第10天6%,之后維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平,經(jīng)共培養(yǎng)之后第8天升至10%。說(shuō)明共培養(yǎng)體系可增加Hb含量,促進(jìn)細(xì)胞的成熟。與此同時(shí),我們以P50儀檢測(cè)了紅系細(xì)胞的攜氧能力,這一方法也是評(píng)價(jià)其他紅細(xì)胞代用品攜氧能力的重要方法。結(jié)果表明,誘導(dǎo)的紅系細(xì)胞具有和成體紅細(xì)胞相似的“S”形氧離曲線,但這一曲線較成人正常紅細(xì)胞氧離曲線位置偏右,表明體外誘導(dǎo)的紅系細(xì)胞具有和成熟紅細(xì)胞相似的攜氧能力,但其攜氧能力較成熟紅細(xì)胞偏弱。 體外誘導(dǎo)的紅細(xì)胞最終應(yīng)用于輸血治療的前提是在細(xì)胞體內(nèi)的能夠活存并對(duì)機(jī)體無(wú)害,即對(duì)于機(jī)體是安全的。鑒于此,我們首先利用非肥胖重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠( nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency disease ,NOD-SCID)為模型,通過(guò)小劑量輻照(2.0 Gy)后,將熒光染料羥基熒光素二醋酸鹽琥珀亞胺脂(Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester,CFSE)標(biāo)記胞漿的誘導(dǎo)紅系組細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)。結(jié)果表明,注射后4小時(shí)內(nèi),小鼠外周血內(nèi)可檢測(cè)到帶有標(biāo)記的細(xì)胞,帶有標(biāo)記的細(xì)胞比例由注射后2小時(shí)0.34%降至4小時(shí)0.13%。經(jīng)30天觀察,小鼠的生存狀況沒(méi)有受到影響,所有注射細(xì)胞的小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均無(wú)死亡現(xiàn)象發(fā)生。表明,體外誘導(dǎo)的紅系細(xì)胞在小鼠體內(nèi)可以活存,對(duì)小鼠生存是安全的。在安全性和確保細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)活存基礎(chǔ)上,為評(píng)價(jià)誘導(dǎo)的紅細(xì)胞對(duì)小鼠貧血癥狀的改善作用,我們對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行腹腔注射苯肼,建立了溶血性貧血模型。最終確定了苯肼致小鼠溶血性貧血發(fā)生的最佳作用劑量為1.2mg/10g bw,注射方式為間隔24小時(shí)連續(xù)兩次注射。同時(shí),我們并觀察到了苯肼致小鼠溶血性貧血發(fā)生發(fā)展的規(guī)律,為此后對(duì)體外誘導(dǎo)的紅細(xì)胞及其他紅細(xì)胞代用品的體內(nèi)功能評(píng)價(jià)進(jìn)行了技術(shù)儲(chǔ)備。 通過(guò)第一、二部分的實(shí)驗(yàn)我們成功的將HSCs誘導(dǎo)成了脫核紅細(xì)胞,并驗(yàn)證了這群細(xì)胞的功能和安全性。由于每一份臍血的量是一定的,臍血中HSCs的比例也是一定的,我們誘導(dǎo)的紅細(xì)胞的總量受限于每一份臍血中HSCs的量。HSCs數(shù)量成為限制體外誘導(dǎo)成熟紅細(xì)胞應(yīng)用的瓶頸。隨著胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ES細(xì)胞)的分離和成功建系1-3,一種新的潛在的血液來(lái)源漸漸走入人們視野。ES細(xì)胞具有理論上體外無(wú)限擴(kuò)增并保持未分化狀態(tài)的能力。越來(lái)越多的研究表明,體外可以由ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化出造血細(xì)胞4-25。因此,以ES細(xì)胞為啟動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行造血誘導(dǎo),可以從根本上解決體外誘導(dǎo)紅細(xì)胞生成的過(guò)程中種子細(xì)胞(造血干/祖細(xì)胞)數(shù)量的問(wèn)題。ES細(xì)胞將是今后一段時(shí)間內(nèi)體外誘導(dǎo)紅細(xì)胞的主要選擇和趨勢(shì)。 第三部分人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)及造血誘導(dǎo) hES細(xì)胞干性的維持需要在特定的飼養(yǎng)層細(xì)胞上生長(zhǎng)并添加特定的細(xì)胞因子。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)經(jīng)γ射線或絲裂霉素C處理終止分裂后可制備成飼養(yǎng)層細(xì)胞用于hES細(xì)胞的培養(yǎng)。本部分實(shí)驗(yàn)中,我們首先分離了制備了MEFs細(xì)胞。在此基礎(chǔ)之上,啟動(dòng)了hES細(xì)胞的培養(yǎng)。hES細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,hES細(xì)胞自發(fā)分化的發(fā)生影響了誘導(dǎo)分化的效率。因此每隔一段時(shí)間,都須對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行干性的鑒定。實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)免疫熒光方法鑒定表明,培養(yǎng)中的hES細(xì)胞細(xì)胞干性維持良好,表達(dá)SSEA-4、Nanog、OCT-4等hES細(xì)胞特異的干性標(biāo)志,不表達(dá)小鼠ES細(xì)胞特異性的干性標(biāo)志SSEA-1。 從hES細(xì)胞誘導(dǎo)獲得紅細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)過(guò)程,在這一系統(tǒng)過(guò)程中,獲得足夠量源于ES的HSCs是限制最終誘導(dǎo)產(chǎn)生的紅細(xì)胞數(shù)量的瓶頸,目前誘導(dǎo)人ES細(xì)胞向造血分化主要有兩種方法,分別為基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)法和EBs擬胚體方法。擬胚體是指在特定的誘導(dǎo)條件下,ES細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)條件下聚集分化形成的由三個(gè)胚層的細(xì)胞組成的囊實(shí)相間的立體結(jié)構(gòu),這其中也包括造血細(xì)胞。在EB形成過(guò)程中,添加特定的細(xì)胞因子可促進(jìn)hES細(xì)胞向某一胚層分化,提高相應(yīng)胚層細(xì)胞的比例。本實(shí)驗(yàn)中,我們以無(wú)血清培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,通過(guò)添加促進(jìn)造血發(fā)育的細(xì)胞因子建立了經(jīng)EBs誘導(dǎo)hES細(xì)胞造血的方法。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)不同誘導(dǎo)時(shí)間EBs中人造血干細(xì)胞特異性標(biāo)記的表達(dá)。結(jié)果表明,EBs形成第5天開(kāi)始即有HSCs的標(biāo)志CD34的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)至第8天的EBs細(xì)胞,HSCs的比例接近1%。 總結(jié) 基于本室以往工作的基礎(chǔ)和對(duì)造血干細(xì)胞生物學(xué)特性的認(rèn)識(shí),本研究通過(guò)在體外無(wú)血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加特定的生長(zhǎng)因子,誘導(dǎo)臍帶血HSCs獲得了高純度的紅系祖細(xì)胞;通過(guò)分離培養(yǎng)人胎肝基質(zhì)細(xì)胞和添加特定功能組分在體外構(gòu)建類似胎肝的造血微環(huán)境,有效促進(jìn)了紅系祖細(xì)胞的脫核成熟。同時(shí),體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明這群細(xì)胞具有一定的功能,能夠在動(dòng)物體內(nèi)活存且對(duì)動(dòng)物安全無(wú)害。由于體外誘導(dǎo)獲得的紅細(xì)胞的數(shù)量由起始HSCs的數(shù)量決定的,源于人ES細(xì)胞的HSCs使我們可以獲得大量的早期造血干/祖細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),從源頭上解決體外誘導(dǎo)紅細(xì)胞種子細(xì)胞不足的問(wèn)題。因此,我們通過(guò)擬胚體法誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞造血分化并獲得了一定比例的HSCs,為最終從人ES細(xì)胞誘導(dǎo)獲得紅細(xì)胞進(jìn)行了初步嘗試。ES細(xì)胞是一個(gè)理論上無(wú)限擴(kuò)增的干細(xì)胞資源,無(wú)需捐獻(xiàn)者便可獲得大規(guī)模HSCs用于臨床治療和成熟誘導(dǎo)。以ES細(xì)胞為啟動(dòng)細(xì)胞的造血干細(xì)胞和紅細(xì)胞誘導(dǎo)代表了今后一段時(shí)間的發(fā)展方向和趨勢(shì),對(duì)于輸血醫(yī)學(xué)具有里程碑式的意義。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2528691