發(fā)布時間：2019-08-19 13:13

【摘要】： 急性白血病(Acute Leukemia,AL)是兒童期發(fā)病率最高的惡性腫瘤。其中B系來源的急性淋巴細(xì)胞性白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL)是兒童白血病最常見的類型。聯(lián)合化療的應(yīng)用雖然明顯改善了兒童ALL的預(yù)后,但仍有20～30%的病死率。治療失敗的主要原因是白血病細(xì)胞耐藥和化療的毒副作用。與化療比較,靶向治療具有高度的選擇性和特異性,因而可大大提高療效,降低藥物的毒副作用。白血病細(xì)胞系列特異性表面分化抗原(Cluster Differentiation,CD)分子的單克隆抗體(Monoclonal Antibody,簡稱單抗,McAb)可以作為白血病/淋巴瘤靶向治療的先導(dǎo)分子。 目前大多數(shù)高親和力的單克隆抗體是鼠源性的,天然的鼠源性單抗應(yīng)用于人體,作為異種蛋白可刺激人體產(chǎn)生人抗鼠抗體(Hhuman Anti-Mouse Antibody,HAMA),既影響單抗的治療效果,又可能誘發(fā)嚴(yán)重的過敏反應(yīng),大大限制了單抗在人體的應(yīng)用;因此有必要對其進(jìn)行降低免疫原性而保留抗原結(jié)合力的改造�？贵w的免疫原性主要位于恒定區(qū)Fc段,而抗原結(jié)合活性位于可變區(qū)Fv段。改造方法之一是制備人-鼠嵌合型抗體,用人的Fc段基因替代鼠Fc段基因,保留鼠源性Fv段基因,然后利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)表達(dá)嵌合抗體蛋白。當(dāng)前臨床使用的抗人CD20嵌合型抗體美羅華(Rituximab)便是嵌合型抗體成功應(yīng)用于臨床的典型代表。 美羅華因其對于CD20+的B系非何杰金淋巴瘤(Non Hodgkin's Lymphoma,NHL)有確切的療效,已被納入該類淋巴瘤的一線治療方案中。但CD20分子在B系分化早期表達(dá)較少,限制了它在B祖細(xì)胞型白血病和部分淋巴瘤中的應(yīng)用。CD19是B細(xì)胞的另一個特異性的表面標(biāo)記,它在B系細(xì)胞表面的持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)貫穿了B細(xì)胞的整個發(fā)育過程。因此,CD19分子可作為理想的先導(dǎo)分子用于治療B細(xì)胞性白血病和淋巴瘤。 目前,國際上正在研究的抗人CD19單抗有多種,大多數(shù)研究結(jié)果表明,無論它們是非結(jié)合型單抗,還是結(jié)合型單抗,動物實驗和臨床治療前研究均顯示出其在靶向治療B淋巴細(xì)胞系惡性腫瘤方面具有較為理想的效果;同時發(fā)現(xiàn),這些不同克隆的抗人CD19抗體與B系腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)性不盡相同,對B系腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用也并非完全一致。更重要的是,到目前為止,臨床上尚無如美羅華一樣在臨床上成功應(yīng)用的CD19單抗制劑,因此,有必要對更多的CD19克隆進(jìn)行基因改造和功能研究。 本課題擬對本實驗室自行研制的、有自主知識產(chǎn)權(quán)并經(jīng)國際鑒定和命名的鼠抗人CD19單抗ZCH-4-2E8(簡稱2E8)進(jìn)行改造,基因工程構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體,并在昆蟲細(xì)胞Sf9中表達(dá),檢測其抗體活性,為該抗體免疫毒素的研制和臨床應(yīng)用以及下一步制備人源化抗體打下基礎(chǔ)。 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在真核表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用較為廣泛,它具有基因容量大,表達(dá)效率高,有表達(dá)后修飾,可操作性和生物安全性好的特點。pAc-κ-CH3桿狀病毒載體是專為表達(dá)抗體而設(shè)計的桿狀病毒載體,它帶有IgGl的重、輕鏈恒定區(qū)(CH、CL),重、輕鏈的前導(dǎo)序列(Leader)及可變區(qū)VH、VL的插入位點,并據(jù)報道抗體表達(dá)量高達(dá)6-18 mg/L。故本研究選擇該系統(tǒng)來表達(dá)目的蛋白。 材料與方法 1、真核分泌型重組桿狀病毒穿梭載體pAc-x-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)的構(gòu)建: 1.1 VH_(2E8)、VL_(2E8)基因的克隆與測序:以本研究室前期研究得到的帶有2E8重、輕鏈可變區(qū)序列(VH_(2E8)、VL_(2E8))的pSectag2A/ScFv_(2E8)質(zhì)粒作為模板,設(shè)計引物通過PCR將XhoⅠ和NheⅠ酶切位點引入VH_(2E8)的兩端,SacⅠ和HindⅢ酶切位點引入VL_(2E8)的兩端;PCR產(chǎn)物電泳后目的條帶切膠回收,純化后將目的基因片段連接入pGEM~(?)-T easy vector(TA克隆),轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,鋪板,挑白色菌落,擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒酶切鑒定并對其進(jìn)行測序核實。 1.2真核分泌型pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)重組桿狀病毒穿梭載體的構(gòu)建:將測序核實過序列正確的TA-VH_(2E8)和pAc-κ-CH3經(jīng)XhoⅠ和NheⅠ雙酶切處理后通過連接、轉(zhuǎn)化、篩選、擴(kuò)增、抽提質(zhì)粒、酶切鑒定等步驟后,測序核實序列正確插入,命名為pAc-κ-CH3-VH_(2E8),再將TA-VL_(2E8)和pAc-κ-CH3-VH_(2E8)經(jīng)SacⅠ和HindⅢ雙酶切處理后通過連接、轉(zhuǎn)化、篩選、擴(kuò)增、抽提質(zhì)粒、酶切鑒定等步驟后,測序核實序列正確插入,從而獲得真核分泌型重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)。用Qiagen plasmid purification mini kit抽提轉(zhuǎn)染級純質(zhì)粒. 2、重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞、擴(kuò)毒、表達(dá)重組抗體: 2.1 Sf9細(xì)胞、2E8細(xì)胞、Nalm-6細(xì)胞、High Five細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng):按照常規(guī)方法進(jìn)行,并進(jìn)行Sf9和High Five細(xì)胞的無血清馴化。 2.2重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞:pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)與AcNPV線性DNA共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,并設(shè)陽性對照和陰性對照各一組。轉(zhuǎn)染后觀察細(xì)胞形態(tài)。4天時收轉(zhuǎn)染陽性對照組細(xì)胞顯色,驗證轉(zhuǎn)染是否成功。7天后收集pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)轉(zhuǎn)染組上清,即為原始重組完整病毒pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV(P0)。收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞備做鑒定。 2.3重組完整病毒pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV感染Sf9細(xì)胞,擴(kuò)毒:以100μl P0感染2×10~6個Sf9細(xì)胞擴(kuò)增第一代完整病毒pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P1,以50μlP1感染2×10~6個Sf9細(xì)胞擴(kuò)增第二代完整病毒pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P2,以20μl P2感染2×10~6個Sf9細(xì)胞的比例擴(kuò)增第三代完整病毒pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3。收各代感染上清作病毒儲存液,收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞制作細(xì)胞裂解液備做鑒定。 2.4人鼠嵌合型CD19基因工程抗體在Sf9細(xì)胞中表達(dá):以MOI(Multiplicity ofInfection,MOI=病毒顆粒數(shù)/感染細(xì)胞數(shù))約為3-10,無血清培養(yǎng)條件下表達(dá)嵌合抗體。感染6天時收集上清和細(xì)胞,備作抗體檢測。 3、重組蛋白的鑒定: 3.1細(xì)胞免疫熒光法、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、Western blot初步鑒定重組抗體在感染的Sf9細(xì)胞的表達(dá)。 3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測重組抗體活性: 3.2.1流式細(xì)胞術(shù)以間標(biāo)法檢測pAC-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細(xì)胞表達(dá)上清中的重組抗體活性:取無血清培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞的表達(dá)上清和未感染Sf9細(xì)胞培養(yǎng)上清各60ml,超濾濃縮300倍后,與Naml-6細(xì)胞共孵育,通過流式細(xì)胞儀觀察FITC標(biāo)記的鼠抗人Fc段(Mouse Anti Human Fc,FITC labelled;MAH-Fc-FITC)和FITC標(biāo)記的羊抗鼠κ鏈(Goat Anti Mouseκchain,FITC labelled;GAM-κ-FITC)作用后的陽性細(xì)胞,以判斷細(xì)胞培養(yǎng)上清中是否存在有活性的重組抗體。 3.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測pAC-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染Sf9細(xì)胞的表達(dá)上清對親本直標(biāo)單抗2E8的阻滯作用:取Sf9細(xì)胞的表達(dá)上清和未感染Sf9細(xì)胞培養(yǎng)上清各60ml,超濾濃縮至400μl后,以100μl/次,阻滯Naml-6細(xì)胞兩次。后通過流式細(xì)胞儀觀察表達(dá)上清對親本直標(biāo)單抗2E8-FITC的阻滯效果。 3.2.3流式細(xì)胞術(shù)間標(biāo)法檢測pAC-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細(xì)胞裂解液中重組蛋白活性:取感染的Sf9細(xì)胞和未感染Sf9細(xì)胞制作裂解液,裂解液處理后與Naml-6細(xì)胞共孵育,通過流式細(xì)胞儀觀察MAH-Fc-FITC和GAM-κ-FITC作用后的陽性細(xì)胞,以判斷細(xì)胞裂解液中是否存在有活性的重組抗體。 4、改進(jìn)裂解液配方,增加重組抗體可溶性及抗體的純化: 4.1用水配合超聲裂解細(xì)胞:取pAC-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細(xì)胞,以2×10~7個細(xì)胞加1ml滅菌雙蒸水,加相應(yīng)的酶抑制劑;超聲功率240W開2秒停2秒,共20次,離心后取上清用于下一步檢測。 4.2配制復(fù)性裂解液,加入氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽,去除去垢劑成分,配合超聲裂解細(xì)胞:取pAC-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細(xì)胞,以2×10~7個細(xì)胞/ml復(fù)性裂解液的比例,加入相應(yīng)的酶抑制劑,配合超聲裂解細(xì)胞,離心后取上清用于下一步純化或檢測。 4.3復(fù)性裂解液裂解感染的Sf9細(xì)胞后,裂解液過Protein A柱純化。 5、以High Five細(xì)胞表達(dá)重組抗體: 5.1以MOI約為5-10,High Five細(xì)胞無血清培養(yǎng)條件下表達(dá)嵌合抗體。感染3天收集上清。 5.2上清濃縮后以流式細(xì)胞術(shù)間標(biāo)法和阻滯法檢測抗體活性。方法同3.2。 結(jié)果 1、真核分泌型重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)的構(gòu)建: 1.1 VH_(2E8),VL_(2E8)基因的擴(kuò)增、連接入pGEM~(?)—T Easy載體(TA克隆)并測序鑒定:PCR產(chǎn)物電泳可見VH_(2E8)泳道380bp左右條帶,VL_(2E8)泳道330bp左右條帶,將目的條帶切膠回收后連接入TA克隆,擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒,酶切鑒定可見有380bp、330bp左右條帶,送測序鑒定。通過DNASIS MAX trail軟件比對測序結(jié)果,所得序列與VH_(2E8)、VL_(2E8)理論序列完全一致。 1.2真核分泌型pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)重組桿狀病毒穿梭載體的構(gòu)建:pAc-κ-CH3和TA-VH_(2E8)雙酶切電泳可見目的條帶,切膠回收,連接后酶切鑒定,可見有預(yù)期大小的條帶,送測序鑒定。比對測序結(jié)果,所得序列與VH_(2E8)理論序列完全一致。再以pAc-κ-CH3-VH_(2E8)和TA-VL_(2E8)雙酶切電泳可見目的條帶,切膠回收,連接后酶切鑒定,可見有預(yù)期大小的條帶,送測序鑒定。比對測序結(jié)果,所得序列與VH_(2E8)、VL_(2E8)理論序列完全一致。真核分泌型重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)構(gòu)建成功。 2、真核分泌型重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞、擴(kuò)毒、表達(dá)重組抗體: 2.1雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)狀態(tài)良好,收集培養(yǎng)上清,得到親本鼠抗人CD19單抗2E8上清,4℃冰箱保存?zhèn)溆�。Sf9和Nalm-6細(xì)胞狀態(tài)良好備用。 2.2重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞:轉(zhuǎn)染后觀察到細(xì)胞大小不一,形態(tài)不規(guī)則,有少量細(xì)胞碎片,細(xì)胞停止增殖等感染征象:轉(zhuǎn)染4天后收獲陽性對照細(xì)胞做顯色呈陽性,轉(zhuǎn)染成功,得到原代桿狀病毒完整病毒株pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P0。 2.3擴(kuò)增完整的重組病毒pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV:經(jīng)過三代擴(kuò)增,100μl PO感染2×10~6個Sf9細(xì)胞擴(kuò)增第一代重組桿狀病毒(P1),50μl P1感染2×10~6個Sf9細(xì)胞擴(kuò)增第二代重組桿狀病毒(P2),20μl P2感染2×10~6個Sf9細(xì)胞擴(kuò)增第二代重組桿狀病毒(P3)。隨代數(shù)增加細(xì)胞感染征象出現(xiàn)越早、越明顯,提示病毒滴度隨代數(shù)增加而增高。 2.4 pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染Sf9細(xì)胞2天,細(xì)胞感染征象即很明顯,6天時存活細(xì)胞約30%(圖4),根據(jù)Baculogold transfection kit說明書選擇細(xì)胞30%存活時收獲上清和細(xì)胞作檢測。 3、重組蛋白的鑒定: 3.1.1細(xì)胞免疫熒光法鑒定轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞內(nèi)的重組蛋白:Sf9細(xì)胞有綠色自發(fā)熒光,無紅色自發(fā)熒光,故選擇發(fā)紅色熒光的羅丹明標(biāo)記的羊抗鼠Fab段(Goat anti mouseFab,rhodamin labelled;GAM-Fab-Rhodamin)作為二抗,檢測pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞7天時收獲的細(xì)胞,結(jié)果見細(xì)胞內(nèi)熒光陽性的細(xì)胞占80%左右,而對照組為陰性。 3.1.2 SDS-PAGE鑒定重組蛋白表達(dá):以含血清或無血清培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞感染pAc-κ-CH3=VH_(2E8)=VL_(2E8)CV P3,表達(dá)上清濃縮10倍跑SDS-PAGE,未見與美羅華重、輕鏈位置相對應(yīng)條帶。同時以感染和未感染Sf9細(xì)胞裂解液和感染Sf9細(xì)胞裂解沉淀跑SDS-PAGE,可以看到與美羅華重、輕鏈對應(yīng)位置的蛋白條帶。 3.1.3 Western blot鑒定重組蛋白表達(dá):經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗β-actin抗體(Anti-β-actin-HRP)標(biāo)記顯影證實細(xì)胞裂解液制備成功;經(jīng)預(yù)實驗選定辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人Fc段單抗(MAH-Fc-HRP)作為二抗做Western blot檢測目的抗體,發(fā)現(xiàn)以含血清或無血清培養(yǎng)pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV感染的Sf9細(xì)胞,表達(dá)上清濃縮10倍檢測,均未見與美羅華重、輕鏈位置相對應(yīng)條帶顯影。而感染Sf9細(xì)胞裂解液有與美羅華重、輕鏈位置相對應(yīng)的條帶,未感染Sf9細(xì)胞無條帶。 3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測重組蛋白活性。 3.2.1流式細(xì)胞術(shù)間標(biāo)法檢測pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細(xì)胞表達(dá)上清中重組抗體:pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細(xì)胞表達(dá)上清以間標(biāo)法未檢測到抗體活性。 3.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染Sf9細(xì)胞的表達(dá)上清對親本直標(biāo)單抗2E8-FITC的阻滯作用:pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細(xì)胞表達(dá)上清中未能檢測到具有阻滯效果的同表位抗體活性。 3.2.3流式細(xì)胞術(shù)間標(biāo)法檢測pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細(xì)胞裂解液中重組蛋白活性:GAM-Fab-FITC組加感染的Sf9細(xì)胞裂解液后陽性細(xì)胞為14.35%(VS 2.97%);MAH-Fc-FITC組加感染的Sf9細(xì)胞裂解液后陽性細(xì)胞為28.67%(VS2.76%),較陰性對照明顯增高,提示細(xì)胞裂解液中存在有活性的重組抗體。 4、改進(jìn)裂解液配方,增加嵌合抗體可溶性及抗體的純化 4.1以水和超聲裂解pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細(xì)胞。 4.1.1以水和超聲裂解感染的Sf9細(xì)胞,裂解上清和沉淀與傳統(tǒng)裂解液跑SDS-PAGE:可見在水裂解的細(xì)胞裂解液中蛋白條帶更淡,但均有與美羅華重、輕鏈對應(yīng)的條帶。 4.1.2以水和超聲裂解感染的Sf9細(xì)胞,裂解液Western blot顯影:可見重組抗體僅有重鏈條帶,沒有輕鏈條帶,而陽性對照有重、輕鏈條帶。 4.2配制復(fù)性裂解液,配合超聲裂解pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細(xì)胞 4.2.1以復(fù)性裂解液,配合超聲裂解感染的細(xì)胞后,過Protein A柱純化嵌合抗體:洗脫時僅在pH6.0洗脫液過柱時看到有一個小洗脫峰,pH5.0、4.0、3.2均未見洗脫峰,收集pH6.0洗脫的蛋白,超濾濃縮后備做Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測。 4.2.2收集洗脫液、過柱液,濃縮后與裂解液一起Western blot鑒定:可見洗脫液泳道無條帶,裂解液和過柱液泳道有淡條帶。 5、以High Five細(xì)胞表達(dá)重組抗體 5.1擴(kuò)大培養(yǎng)High Five細(xì)胞并無血清馴化,表達(dá)重組抗體。 5.2流式細(xì)胞術(shù)檢測重組蛋白活性。 5.2.1流式細(xì)胞術(shù)間標(biāo)法檢測pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的High Five細(xì)胞表達(dá)上清中重組抗體:pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的High Five細(xì)胞表達(dá)上清以間標(biāo)法未檢測到抗體活性。 5.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染High Five細(xì)胞的表達(dá)上清對親本直標(biāo)單抗2E8-FITC的阻滯作用:pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的High Five細(xì)胞表達(dá)上清中未能檢測到具有阻滯效果的同表位抗體活性。 結(jié)論 1、本研究成功地構(gòu)建了抗人CD19人鼠嵌合型基因工程抗體的重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)。 2、重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞得到有感染性的完整重組桿狀病毒株pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV。 3、成功地擴(kuò)增pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV至第三代,得到高滴度的病毒儲存液。 4、抗人CD19人鼠嵌合型基因工程抗體Hm2E8在Sf9細(xì)胞中表達(dá)得到了有活性的重組抗體。 5、表達(dá)的重組抗體大多以沉淀形式存在于細(xì)胞內(nèi);目前重組抗體在Sf9和High Five細(xì)胞中均未能分泌表達(dá)。改進(jìn)裂解液配方、采用超聲裂解未能增加Sf9中表達(dá)的重組抗體的可溶性。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2528277