【摘要】： 急性白血病(Acute Leukemia,AL)是兒童期發(fā)病率最高的惡性腫瘤。其中B系來源的急性淋巴細胞性白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL)是兒童白血病最常見的類型。聯(lián)合化療的應用雖然明顯改善了兒童ALL的預后,但仍有20～30%的病死率。治療失敗的主要原因是白血病細胞耐藥和化療的毒副作用。與化療比較,靶向治療具有高度的選擇性和特異性,因而可大大提高療效,降低藥物的毒副作用。白血病細胞系列特異性表面分化抗原(Cluster Differentiation,CD)分子的單克隆抗體(Monoclonal Antibody,簡稱單抗,McAb)可以作為白血病/淋巴瘤靶向治療的先導分子。 目前大多數(shù)高親和力的單克隆抗體是鼠源性的,天然的鼠源性單抗應用于人體,作為異種蛋白可刺激人體產生人抗鼠抗體(Hhuman Anti-Mouse Antibody,HAMA),既影響單抗的治療效果,又可能誘發(fā)嚴重的過敏反應,大大限制了單抗在人體的應用;因此有必要對其進行降低免疫原性而保留抗原結合力的改造�？贵w的免疫原性主要位于恒定區(qū)Fc段,而抗原結合活性位于可變區(qū)Fv段。改造方法之一是制備人-鼠嵌合型抗體,用人的Fc段基因替代鼠Fc段基因,保留鼠源性Fv段基因,然后利用現(xiàn)代基因工程技術表達嵌合抗體蛋白。當前臨床使用的抗人CD20嵌合型抗體美羅華(Rituximab)便是嵌合型抗體成功應用于臨床的典型代表。 美羅華因其對于CD20+的B系非何杰金淋巴瘤(Non Hodgkin's Lymphoma,NHL)有確切的療效,已被納入該類淋巴瘤的一線治療方案中。但CD20分子在B系分化早期表達較少,限制了它在B祖細胞型白血病和部分淋巴瘤中的應用。CD19是B細胞的另一個特異性的表面標記,它在B系細胞表面的持續(xù)穩(wěn)定表達貫穿了B細胞的整個發(fā)育過程。因此,CD19分子可作為理想的先導分子用于治療B細胞性白血病和淋巴瘤。 目前,國際上正在研究的抗人CD19單抗有多種,大多數(shù)研究結果表明,無論它們是非結合型單抗,還是結合型單抗,動物實驗和臨床治療前研究均顯示出其在靶向治療B淋巴細胞系惡性腫瘤方面具有較為理想的效果;同時發(fā)現(xiàn),這些不同克隆的抗人CD19抗體與B系腫瘤細胞的反應性不盡相同,對B系腫瘤細胞的選擇性殺傷作用也并非完全一致。更重要的是,到目前為止,臨床上尚無如美羅華一樣在臨床上成功應用的CD19單抗制劑,因此,有必要對更多的CD19克隆進行基因改造和功能研究。 本課題擬對本實驗室自行研制的、有自主知識產權并經國際鑒定和命名的鼠抗人CD19單抗ZCH-4-2E8(簡稱2E8)進行改造,基因工程構建桿狀病毒表達載體,并在昆蟲細胞Sf9中表達,檢測其抗體活性,為該抗體免疫毒素的研制和臨床應用以及下一步制備人源化抗體打下基礎。 桿狀病毒表達系統(tǒng)在真核表達系統(tǒng)中應用較為廣泛,它具有基因容量大,表達效率高,有表達后修飾,可操作性和生物安全性好的特點。pAc-κ-CH3桿狀病毒載體是專為表達抗體而設計的桿狀病毒載體,它帶有IgGl的重、輕鏈恒定區(qū)(CH、CL),重、輕鏈的前導序列(Leader)及可變區(qū)VH、VL的插入位點,并據(jù)報道抗體表達量高達6-18 mg/L。故本研究選擇該系統(tǒng)來表達目的蛋白。 材料與方法 1、真核分泌型重組桿狀病毒穿梭載體pAc-x-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)的構建: 1.1 VH_(2E8)、VL_(2E8)基因的克隆與測序:以本研究室前期研究得到的帶有2E8重、輕鏈可變區(qū)序列(VH_(2E8)、VL_(2E8))的pSectag2A/ScFv_(2E8)質粒作為模板,設計引物通過PCR將XhoⅠ和NheⅠ酶切位點引入VH_(2E8)的兩端,SacⅠ和HindⅢ酶切位點引入VL_(2E8)的兩端;PCR產物電泳后目的條帶切膠回收,純化后將目的基因片段連接入pGEM~(?)-T easy vector(TA克隆),轉化大腸桿菌DH5α,鋪板,挑白色菌落,擴增后抽提質粒酶切鑒定并對其進行測序核實。 1.2真核分泌型pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)重組桿狀病毒穿梭載體的構建:將測序核實過序列正確的TA-VH_(2E8)和pAc-κ-CH3經XhoⅠ和NheⅠ雙酶切處理后通過連接、轉化、篩選、擴增、抽提質粒、酶切鑒定等步驟后,測序核實序列正確插入,命名為pAc-κ-CH3-VH_(2E8),再將TA-VL_(2E8)和pAc-κ-CH3-VH_(2E8)經SacⅠ和HindⅢ雙酶切處理后通過連接、轉化、篩選、擴增、抽提質粒、酶切鑒定等步驟后,測序核實序列正確插入,從而獲得真核分泌型重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)。用Qiagen plasmid purification mini kit抽提轉染級純質粒. 2、重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)轉染Sf9細胞、擴毒、表達重組抗體: 2.1 Sf9細胞、2E8細胞、Nalm-6細胞、High Five細胞的復蘇與培養(yǎng):按照常規(guī)方法進行,并進行Sf9和High Five細胞的無血清馴化。 2.2重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)轉染Sf9細胞:pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)與AcNPV線性DNA共轉染Sf9細胞,并設陽性對照和陰性對照各一組。轉染后觀察細胞形態(tài)。4天時收轉染陽性對照組細胞顯色,驗證轉染是否成功。7天后收集pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)轉染組上清,即為原始重組完整病毒pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV(P0)。收集轉染細胞備做鑒定。 2.3重組完整病毒pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV感染Sf9細胞,擴毒:以100μl P0感染2×10~6個Sf9細胞擴增第一代完整病毒pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P1,以50μlP1感染2×10~6個Sf9細胞擴增第二代完整病毒pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P2,以20μl P2感染2×10~6個Sf9細胞的比例擴增第三代完整病毒pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3。收各代感染上清作病毒儲存液,收集轉染細胞制作細胞裂解液備做鑒定。 2.4人鼠嵌合型CD19基因工程抗體在Sf9細胞中表達:以MOI(Multiplicity ofInfection,MOI=病毒顆粒數(shù)/感染細胞數(shù))約為3-10,無血清培養(yǎng)條件下表達嵌合抗體。感染6天時收集上清和細胞,備作抗體檢測。 3、重組蛋白的鑒定: 3.1細胞免疫熒光法、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、Western blot初步鑒定重組抗體在感染的Sf9細胞的表達。 3.2流式細胞術檢測重組抗體活性: 3.2.1流式細胞術以間標法檢測pAC-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細胞表達上清中的重組抗體活性:取無血清培養(yǎng)的Sf9細胞的表達上清和未感染Sf9細胞培養(yǎng)上清各60ml,超濾濃縮300倍后,與Naml-6細胞共孵育,通過流式細胞儀觀察FITC標記的鼠抗人Fc段(Mouse Anti Human Fc,FITC labelled;MAH-Fc-FITC)和FITC標記的羊抗鼠κ鏈(Goat Anti Mouseκchain,FITC labelled;GAM-κ-FITC)作用后的陽性細胞,以判斷細胞培養(yǎng)上清中是否存在有活性的重組抗體。 3.2.2流式細胞術檢測pAC-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染Sf9細胞的表達上清對親本直標單抗2E8的阻滯作用:取Sf9細胞的表達上清和未感染Sf9細胞培養(yǎng)上清各60ml,超濾濃縮至400μl后,以100μl/次,阻滯Naml-6細胞兩次。后通過流式細胞儀觀察表達上清對親本直標單抗2E8-FITC的阻滯效果。 3.2.3流式細胞術間標法檢測pAC-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細胞裂解液中重組蛋白活性:取感染的Sf9細胞和未感染Sf9細胞制作裂解液,裂解液處理后與Naml-6細胞共孵育,通過流式細胞儀觀察MAH-Fc-FITC和GAM-κ-FITC作用后的陽性細胞,以判斷細胞裂解液中是否存在有活性的重組抗體。 4、改進裂解液配方,增加重組抗體可溶性及抗體的純化: 4.1用水配合超聲裂解細胞:取pAC-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細胞,以2×10~7個細胞加1ml滅菌雙蒸水,加相應的酶抑制劑;超聲功率240W開2秒停2秒,共20次,離心后取上清用于下一步檢測。 4.2配制復性裂解液,加入氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽,去除去垢劑成分,配合超聲裂解細胞:取pAC-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細胞,以2×10~7個細胞/ml復性裂解液的比例,加入相應的酶抑制劑,配合超聲裂解細胞,離心后取上清用于下一步純化或檢測。 4.3復性裂解液裂解感染的Sf9細胞后,裂解液過Protein A柱純化。 5、以High Five細胞表達重組抗體: 5.1以MOI約為5-10,High Five細胞無血清培養(yǎng)條件下表達嵌合抗體。感染3天收集上清。 5.2上清濃縮后以流式細胞術間標法和阻滯法檢測抗體活性。方法同3.2。 結果 1、真核分泌型重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)的構建: 1.1 VH_(2E8),VL_(2E8)基因的擴增、連接入pGEM~(?)—T Easy載體(TA克隆)并測序鑒定:PCR產物電泳可見VH_(2E8)泳道380bp左右條帶,VL_(2E8)泳道330bp左右條帶,將目的條帶切膠回收后連接入TA克隆,擴增后抽提質粒,酶切鑒定可見有380bp、330bp左右條帶,送測序鑒定。通過DNASIS MAX trail軟件比對測序結果,所得序列與VH_(2E8)、VL_(2E8)理論序列完全一致。 1.2真核分泌型pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)重組桿狀病毒穿梭載體的構建:pAc-κ-CH3和TA-VH_(2E8)雙酶切電泳可見目的條帶,切膠回收,連接后酶切鑒定,可見有預期大小的條帶,送測序鑒定。比對測序結果,所得序列與VH_(2E8)理論序列完全一致。再以pAc-κ-CH3-VH_(2E8)和TA-VL_(2E8)雙酶切電泳可見目的條帶,切膠回收,連接后酶切鑒定,可見有預期大小的條帶,送測序鑒定。比對測序結果,所得序列與VH_(2E8)、VL_(2E8)理論序列完全一致。真核分泌型重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)構建成功。 2、真核分泌型重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)轉染Sf9細胞、擴毒、表達重組抗體: 2.1雜交瘤細胞復蘇后培養(yǎng)狀態(tài)良好,收集培養(yǎng)上清,得到親本鼠抗人CD19單抗2E8上清,4℃冰箱保存?zhèn)溆�。Sf9和Nalm-6細胞狀態(tài)良好備用。 2.2重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)轉染Sf9細胞:轉染后觀察到細胞大小不一,形態(tài)不規(guī)則,有少量細胞碎片,細胞停止增殖等感染征象:轉染4天后收獲陽性對照細胞做顯色呈陽性,轉染成功,得到原代桿狀病毒完整病毒株pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P0。 2.3擴增完整的重組病毒pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV:經過三代擴增,100μl PO感染2×10~6個Sf9細胞擴增第一代重組桿狀病毒(P1),50μl P1感染2×10~6個Sf9細胞擴增第二代重組桿狀病毒(P2),20μl P2感染2×10~6個Sf9細胞擴增第二代重組桿狀病毒(P3)。隨代數(shù)增加細胞感染征象出現(xiàn)越早、越明顯,提示病毒滴度隨代數(shù)增加而增高。 2.4 pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染Sf9細胞2天,細胞感染征象即很明顯,6天時存活細胞約30%(圖4),根據(jù)Baculogold transfection kit說明書選擇細胞30%存活時收獲上清和細胞作檢測。 3、重組蛋白的鑒定: 3.1.1細胞免疫熒光法鑒定轉染Sf9細胞內的重組蛋白:Sf9細胞有綠色自發(fā)熒光,無紅色自發(fā)熒光,故選擇發(fā)紅色熒光的羅丹明標記的羊抗鼠Fab段(Goat anti mouseFab,rhodamin labelled;GAM-Fab-Rhodamin)作為二抗,檢測pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)轉染Sf9細胞7天時收獲的細胞,結果見細胞內熒光陽性的細胞占80%左右,而對照組為陰性。 3.1.2 SDS-PAGE鑒定重組蛋白表達:以含血清或無血清培養(yǎng)的Sf9細胞感染pAc-κ-CH3=VH_(2E8)=VL_(2E8)CV P3,表達上清濃縮10倍跑SDS-PAGE,未見與美羅華重、輕鏈位置相對應條帶。同時以感染和未感染Sf9細胞裂解液和感染Sf9細胞裂解沉淀跑SDS-PAGE,可以看到與美羅華重、輕鏈對應位置的蛋白條帶。 3.1.3 Western blot鑒定重組蛋白表達:經辣根過氧化物酶標記的抗β-actin抗體(Anti-β-actin-HRP)標記顯影證實細胞裂解液制備成功;經預實驗選定辣根過氧化物酶標記的鼠抗人Fc段單抗(MAH-Fc-HRP)作為二抗做Western blot檢測目的抗體,發(fā)現(xiàn)以含血清或無血清培養(yǎng)pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV感染的Sf9細胞,表達上清濃縮10倍檢測,均未見與美羅華重、輕鏈位置相對應條帶顯影。而感染Sf9細胞裂解液有與美羅華重、輕鏈位置相對應的條帶,未感染Sf9細胞無條帶。 3.2流式細胞術檢測重組蛋白活性。 3.2.1流式細胞術間標法檢測pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細胞表達上清中重組抗體:pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細胞表達上清以間標法未檢測到抗體活性。 3.2.2流式細胞術檢測pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染Sf9細胞的表達上清對親本直標單抗2E8-FITC的阻滯作用:pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細胞表達上清中未能檢測到具有阻滯效果的同表位抗體活性。 3.2.3流式細胞術間標法檢測pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細胞裂解液中重組蛋白活性:GAM-Fab-FITC組加感染的Sf9細胞裂解液后陽性細胞為14.35%(VS 2.97%);MAH-Fc-FITC組加感染的Sf9細胞裂解液后陽性細胞為28.67%(VS2.76%),較陰性對照明顯增高,提示細胞裂解液中存在有活性的重組抗體。 4、改進裂解液配方,增加嵌合抗體可溶性及抗體的純化 4.1以水和超聲裂解pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細胞。 4.1.1以水和超聲裂解感染的Sf9細胞,裂解上清和沉淀與傳統(tǒng)裂解液跑SDS-PAGE:可見在水裂解的細胞裂解液中蛋白條帶更淡,但均有與美羅華重、輕鏈對應的條帶。 4.1.2以水和超聲裂解感染的Sf9細胞,裂解液Western blot顯影:可見重組抗體僅有重鏈條帶,沒有輕鏈條帶,而陽性對照有重、輕鏈條帶。 4.2配制復性裂解液,配合超聲裂解pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的Sf9細胞 4.2.1以復性裂解液,配合超聲裂解感染的細胞后,過Protein A柱純化嵌合抗體:洗脫時僅在pH6.0洗脫液過柱時看到有一個小洗脫峰,pH5.0、4.0、3.2均未見洗脫峰,收集pH6.0洗脫的蛋白,超濾濃縮后備做Western blot和流式細胞術檢測。 4.2.2收集洗脫液、過柱液,濃縮后與裂解液一起Western blot鑒定:可見洗脫液泳道無條帶,裂解液和過柱液泳道有淡條帶。 5、以High Five細胞表達重組抗體 5.1擴大培養(yǎng)High Five細胞并無血清馴化,表達重組抗體。 5.2流式細胞術檢測重組蛋白活性。 5.2.1流式細胞術間標法檢測pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的High Five細胞表達上清中重組抗體:pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的High Five細胞表達上清以間標法未檢測到抗體活性。 5.2.2流式細胞術檢測pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染High Five細胞的表達上清對親本直標單抗2E8-FITC的阻滯作用:pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV P3感染的High Five細胞表達上清中未能檢測到具有阻滯效果的同表位抗體活性。 結論 1、本研究成功地構建了抗人CD19人鼠嵌合型基因工程抗體的重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)。 2、重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)轉染Sf9細胞得到有感染性的完整重組桿狀病毒株pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV。 3、成功地擴增pAc-κ-CH3-VH_(2E8)-VL_(2E8)CV至第三代,得到高滴度的病毒儲存液。 4、抗人CD19人鼠嵌合型基因工程抗體Hm2E8在Sf9細胞中表達得到了有活性的重組抗體。 5、表達的重組抗體大多以沉淀形式存在于細胞內;目前重組抗體在Sf9和High Five細胞中均未能分泌表達。改進裂解液配方、采用超聲裂解未能增加Sf9中表達的重組抗體的可溶性。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 吳宏菊;張清媛;陳德發(fā);關小軍;張伯龍;馬軍;;美羅華聯(lián)合CHOP方案與CHOP方案治療初治彌漫性大B細胞淋巴瘤的臨床對比研究[J];癌癥;2005年12期

2 尤蓓,李彪,陸盈,曹文俊,尹桂芝,張一帆,趙龍,賈世海,于金德;重組桿狀病毒載體在哺乳動物細胞中的表達[J];上海第二醫(yī)科大學學報;2004年10期

3 潘春華,羅榮城,菜紅兵;美羅華在非何杰金淋巴瘤治療方面的新用法及療效觀察[J];細胞與分子免疫學雜志;2003年05期

4 湯永民，郭淑芬，徐淑芝，沈紅強，宋華;ZCH－系列單克隆抗體在急性白血病細胞上的表達及其意義[J];中華血液學雜志;1995年01期

5 湯永民，郭淑芬，，徐淑芝，沈紅強，潘秋爐，厲　華;B細胞系特異性單克隆抗體ZCH－4－2E8的制備鑒定及其初步應用[J];浙江醫(yī)科大學學報;1994年06期

6 陳英虎,湯永民,沈紅強,宋華,楊世隆,石淑文,錢柏芹,徐衛(wèi)群,寧鉑濤;急性白血病患者白血病細胞CD19和CD20反應譜分析[J];浙江醫(yī)學;2003年08期

本文編號：2528277