【摘要】： 目前關(guān)于動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)發(fā)病機制的研究中,占主導地位的是由R.Ross提出的又不斷加以修正的“損傷—反應假說”(theResponse-to-Injury Hypothesis)和“炎癥假說”(the Inflammaion Hypothesis)。兩假說均認為血管內(nèi)皮細胞(endothelial cells,EC)損傷、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖在AS發(fā)生中起著關(guān)鍵作用,其中內(nèi)皮細胞損傷被認為是AS病灶形成的始動環(huán)節(jié)。在假說的論述中一直未提及外膜在AS病灶形成和發(fā)展中的作用。傳統(tǒng)上認為外膜只是血管外周一層松散的結(jié)締組織,僅僅對滋養(yǎng)血管和交感神經(jīng)末梢起支持作用。因為其明顯的邊緣位置使血管外膜一直未成為人們關(guān)注的焦點。血管外膜特別是成纖維細胞在AS病灶形成和發(fā)展中的作用也不甚明了。 近年來,對于血管外膜究竟是心血管病變中無作用的旁觀者還是積極的參與者逐漸引起研究者的重視。有研究資料提示血管外膜通過直接或間接作用對血管的結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)起著重要的調(diào)控作用。成纖維細胞作為血管外膜最主要的細胞類型,在血管病變過程中表現(xiàn)出組織學、生物化學和功能特性的變化,以調(diào)節(jié)血管對損傷和應激的反應能力。1962年Schwart和Mitchell對隨機選擇的111例35歲以上的男性和女性的440張組織切片進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血管外膜炎癥程度與AS病變程度成正相關(guān),并對血管外膜炎細胞的浸潤程度進行了分級。KimRayner則在基因水平上進一步闡明外膜炎癥對AS病灶形成的影響。他用原位雜交方法連續(xù)觀察高脂喂養(yǎng)0—12周載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein Eknockout,apoE(-/-))小鼠主動脈切片,發(fā)現(xiàn)在AS病灶形成中,單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,JE/MCP-1)及其受體C-C趨化受體2(C-C chemokine receptor—2,CCR-2)的mRNA表達最早見于外膜的間質(zhì)細胞,隨后才出現(xiàn)大量表達MCP-1的巨噬細胞。從而提示在內(nèi)膜損傷之前外膜中即有炎細胞的浸潤。Mori等將MCP-1突變基因轉(zhuǎn)染至球囊損傷的兔頸動脈局部骨骼肌后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染抑制了MCP-1介導的炎癥反應,外膜巨噬細胞的聚集被顯著抑制,外膜纖維化程度減輕,從而使病理性血管重塑減弱。有報道血管外膜細胞外基質(zhì)的組成成分在AS和再狹窄的過程中也發(fā)生改變。Durmowicz等觀察到血管外膜膠原和彈性蛋白產(chǎn)生和積聚在肺動脈高壓進程中顯著增加。Zalewski報告冠狀動脈球囊成形術(shù)后先有外膜成纖維細胞的增殖,然后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞(myofibroblast,MF)遷移到新生內(nèi)膜。而且在頸動脈動—靜脈移植中,外膜成纖維細胞的增生、向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化、向新生內(nèi)膜的遷移都早于新生內(nèi)膜的增生。但是在這些相關(guān)研究報道中多數(shù)認為血管外膜炎癥及其他外膜的反應都是AS等心血管疾病的晚期病理變化。國內(nèi)外關(guān)于血管外膜參與AS病灶形成尤其是早期病灶形成的報道也非常少。 我實驗室在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)apoE(-/-)小鼠冠狀動脈(coronaryartery,CA)主干和心肌內(nèi)CA小分支部分外膜區(qū)域有炎性細胞聚集,從而誘發(fā)該段AS病灶形成和延伸。 目的: 為進一步探討血管外膜在AS病灶形成和進展中的作用,本課題擬通過整體動物實驗研究aopE(-/-)小鼠血管外膜尤其是外膜成纖維細胞在AS發(fā)展的不同階段在表型轉(zhuǎn)化、增殖、遷移、膠原合成和各種細胞因子表達水平的動態(tài)變化,進一步更加系統(tǒng)地研究血管外膜特別是成纖維細胞激活與AS病灶形成和發(fā)展的關(guān)系。另外,我們亦通過體外培養(yǎng)apoE(-/-)小鼠血管外膜成纖維細胞,觀察其與對照組野生型C57BL/6小鼠在細胞表型、功能特性和基因表達譜的差異,從中選擇差異基因進行分析,進一步系統(tǒng)探討血管外膜成纖維細胞參與AS病灶形成的機制。因血管外膜的特殊位置,可以從中選取興趣基因以外膜為作用靶點進行基因治療,從而為AS的治療開辟新的途徑,同時也為我們提出假說—血管外膜成纖維細胞激活,促使早期動脈粥樣硬化病灶形成及病灶的進展提供試驗依據(jù)。本課題將分以下三個部分進行研究和討論: 第一部分:整體動物實驗研究血管外膜激活在AS病灶形成及發(fā)展中的作用 方法: 選擇6周齡apoE-/-小鼠和野生型C57BL/6小鼠,分別給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料84.75%、飽和脂肪15%、膽固醇0.25%)0、2、4、和8周。在各個時間點處死動物前24小時經(jīng)腹腔注射5—溴—2—脫氧尿嘧啶(BrdU),選取升主動脈制備連續(xù)切片。部分切片進行HE及Movat染色,以觀察組織形態(tài)學的變化并測量外膜厚度的變化。部分切片行天狼猩紅染色,偏振光分析Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原分布和含量的變化。用免疫組化方法觀察不同階段血管外膜和內(nèi)膜α平滑肌肌動蛋白(α-Smooth Muscle-actin,α-SM-actin)、波形蛋白(vimentin)、結(jié)蛋白(desmin)、BrdU、MCP-1、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesionmolecule-1,ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(Vascular cell adhesionmolecule-1,VCAM-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β_1(transforming growth factor beta 1,TGF-β_1)及p47phox等細胞因子表達水平的動態(tài)變化。用熒光原位雜交技術(shù)檢測JE/MCP-1mRNA的表達。 結(jié)果顯示: 1.apoE(-/-)小鼠血管外膜厚度隨著高脂喂養(yǎng)時間延長逐漸增加。其在高脂喂養(yǎng)4周后動脈內(nèi)膜出現(xiàn)泡沫細胞,高脂喂養(yǎng)8周后內(nèi)膜AS病灶進一步發(fā)展。而C57BL/6小鼠血管外膜厚度在高脂喂養(yǎng)的各個時間點沒有顯著變化,而且也未觀察到內(nèi)膜損傷的任何跡象。 2.高脂喂養(yǎng)2周、4周后的apoE(-/-)小鼠外膜細胞檢測到少量α-SM-actin的陽性表達,8W后幾乎無α-SM-actin的表達,desmin始終呈陰性,大部分細胞呈現(xiàn)vimentin陽性,顯示檢測細胞為成纖維細胞,并表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞的特性。C57BL/6小鼠血管外膜始終未檢測到α-SM-actin的陽性表達。3.apoE(-/-)小鼠隨著高脂喂養(yǎng)時間延長,主動脈外膜膠原含量增加,均高于對照組C57BL/6小鼠。高脂喂養(yǎng)前及2周后,主動脈外膜膠原主要為Ⅲ型膠原,而高脂喂養(yǎng)4周,8周后,Ⅰ型膠原所占比例增加。而C57BL/6小鼠在高脂喂養(yǎng)前后主動脈外膜膠原合成無顯著性變化。 4.6周齡apoE(-/-)小鼠高脂喂養(yǎng)2周后,在無可見內(nèi)膜病灶形成之前,首先在主動脈外膜發(fā)現(xiàn)BrdU陽性細胞,之后才在損傷內(nèi)膜觀察到BrdU標記細胞。而C57BL/6小鼠高脂喂養(yǎng)前后并未檢測到BrdU標記的細胞。 5.apoE(-/-)小鼠在內(nèi)膜沒有任何病灶形成之前,外膜已經(jīng)檢測到MCP-1mRNA及蛋白,TGF-β_1,p47phox,VCAM-1的表達,隨著高脂喂養(yǎng)時間增加,主動脈外膜滋養(yǎng)血管內(nèi)膜ICAM-1的表達也增加。在C57BL/6小鼠主動脈外膜也檢測到ICAM-1的表達,但其表達量少且穩(wěn)定,各時間點之間無明顯變化,另外其主動脈外膜也有極少量p47phox表達,但高脂喂養(yǎng)前后并沒有顯著變化。 結(jié)論: 1.在apoE(-/-)小鼠動脈粥樣硬化病灶出現(xiàn)之前,動脈外膜首先被激活,其主要表現(xiàn)是成纖維細胞激活,并促使病灶的形成和進展。 2.在高脂血癥等危險因素作用下,在動脈內(nèi)膜病灶形成之前,動脈外膜成纖維細胞表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞的特性、合成膠原纖維增多、增殖活性增強、合成和釋放活性細胞因子增多。 3.在高脂血癥等危險因素作用下,在動脈內(nèi)膜病灶形成之前,外膜滋養(yǎng)血管黏附分子表達增多,這也是外膜激活的表現(xiàn)之一。 4.氧化應激既是血管外膜成纖維細胞激活的原因之一,又是成纖維細胞激活后通過旁分泌和自分泌方式,促進病灶形成和發(fā)展的重要機理之一。 5.動脈外膜炎癥是動脈粥樣硬化病灶形成和發(fā)展過程中的早期事件之一。 第二部分:體外培養(yǎng)血管外膜成纖維細胞研究其在AS病灶形成及發(fā)展中的作用 方法: 取6周齡apoE(-/-)小鼠和野生型C57BL/6小鼠,在高脂2周后用組織塊法體外培養(yǎng)血管外膜成纖維細胞,取3～7代細胞用于實驗。用免疫熒光法檢測vimentin、desmin和α-SM-actin的表達,結(jié)合透射電鏡觀察細胞表型變化。用羥脯氨酸測試盒測定膠原合成情況。分別用CCK-8測試盒及BrdU摻入法測定細胞增殖活性的變化,流式細胞PI染色測定細胞周期。用插入式Transwell小室檢測細胞的遷移能力。NADPH氧化酶活性檢測試劑盒及超氧陰離子檢測試劑盒檢測細胞NADPH氧化酶活性及超氧陰離子的生成。應用NADPH氧化酶的特異性抑制劑DPI作用于細胞然后再檢測細胞的增殖和遷移活性,觀察NADPH氧化酶對成纖維細胞增殖和遷移活性的影響。采用基因芯片技術(shù)觀察細胞基因表達譜的差異,然后用RT-PCR和Western-blot在mRNA和蛋白水平上進一步驗證部分差異基因。將p47phox基因的Stealth siRNA,轉(zhuǎn)染apoE(-/-)小鼠血管外膜成纖維細胞,觀察其對apoE(-/-)小鼠血管外膜成纖維細胞NADPH氧化酶的抑制作用及其對細胞增殖和遷移活性的阻斷效應。 結(jié)果顯示: 1.兩組小鼠培養(yǎng)血管外膜細胞均呈現(xiàn)vimentin(+),desmin(-),表現(xiàn)出典型成纖維細胞的特征。apoE(-/-)小鼠有少量細胞表現(xiàn)為α-SM-actin陽性,有部分超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,可見肌絲明顯增多。而C57BL/6小鼠培養(yǎng)細胞未檢測到α-SM-actin的陽性表達,超微結(jié)構(gòu)也無明顯變化。 2.apoE(-/-)小鼠血管外膜成纖維細胞合成膠原量高于C57BL/6小鼠,兩組之間有顯著性差異。 3.血清濃度為5%,10%,20%時,apoE(-/-)小鼠血管外膜成纖維細胞增殖活性明顯高于C57BL/6小鼠,BrdU摻入法也得到相同結(jié)果。apoE(-/-)小鼠血管外膜成纖維細胞S期及G_2/M期所占百分比明顯高于對照組C57BL/6小鼠。 4.apoE(-/-)小鼠與C57BL/6小鼠相比,培養(yǎng)的外膜成纖維細胞遷移到Transwell小室下室的細胞數(shù)明顯增多,兩組之間有顯著性差異。 5.apoE(-/-)小鼠較C57BL/6小鼠血管外膜成纖維細胞NADPH氧化酶活性增加,超氧陰離子生成增多,兩組間有顯著性差異。 6.應用NADPH氧化酶的特異性抑制劑DPI作用于細胞可明顯降低培養(yǎng)細胞NADPH氧化酶活性,減少超氧陰離子生成,apoE(-/-)小鼠細胞增殖和遷移活性受到顯著抑制。 7.apoE(-/-)小鼠和C57BL/6小鼠成纖維細胞基因芯片檢測結(jié)果顯示:apoE(-/-)小鼠成纖維細胞中癌基因如Rab3a、Rab1、Fyn、c-Met等,生長因子如PDGF、FGF、TGF等,炎性因子如IL-4、Tnfsf等,趨化因子如MCP-5、CCR-2、CCR-5等,黏附分子如ICAM-2、Itga3、CD36等,細胞外基質(zhì)如collagen、Fbn2、TN-C、Fibulin4等,還有一些酶類如Noxol、Mapk、Prkcbpl等基因都是上調(diào)的;而凋亡相關(guān)基因、抑癌基因都是下調(diào)的。差異表達基因主要與細胞生長,氧化應激,信號轉(zhuǎn)導,炎癥,細胞黏附等生物過程有關(guān)。 8.apoE(-/-)小鼠成纖維細胞collagenⅠ、collagenⅢ、TGF-β_1、MCP-1、CCR-2、PDGF-b及p47phox的mRNA水平都明顯高于對照組小鼠。TGF-β_1、MCP-1、PDGF-b及p47phox的蛋白表達水平與RT-PCR結(jié)果是相一致的,明顯高于對照組小鼠。 9.轉(zhuǎn)染apoE(-/-)小鼠成纖維細胞p47phox Stealth siRNA(MSS206956)48h后可有效抑制p47phox基因的表達,抑制NADPH氧化酶的活性,并可顯著減輕成纖維細胞的增殖和遷移活性。 結(jié)論: 1.apoE(-/-)小鼠與C57BL/6小鼠的成纖維細胞相比,部分轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞。 2.apoE(-/-)小鼠與C57BL/6小鼠成纖維細胞相比表現(xiàn)出更強的增殖、遷移活性、NADPH氧化酶活性、膠原合成能力和釋放活性細胞因子的能力。 3.氧化應激參與外膜成纖維細胞的激活,激活的成纖維細胞又通過NADPH氧化酶活性增強生成更多的氧自由基,促進成纖維細胞的增殖及遷移活性。 4.動脈外膜成纖維細胞NADPH氧化酶亞組分p47phox可作為動脈粥樣硬化基因治療的靶點。 第三部分:提出新的假說 根據(jù)整體動物實驗,體外實驗的實驗證據(jù),我們提出一個新的假說—血管外膜成纖維細胞激活,促使早期動脈粥樣硬化病灶形成及病灶的進展。這將是對損傷—反應假說和炎癥假說的一個補充。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R363

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本文編號：2527931